Charakterisierung Cytokin-induzierter Signaltransduktionswege : TNF-Rezeptor assoziierter Faktor 4 (TRAF4) als neuer Ligand der p70S6 Kinase

Fleckenstein, Diana Silke

Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einfluß Cytokin-induzierter Signaltransduktionen auf die Proliferation hämatopoietischer Zellen untersucht werden. In Hemmstoffversuchen wurde deutlich, dass sowohl der PI3K/p70S6K als auch der Ras/Raf/MAPK Signaltransduktionsweg proliferative aber auch anti-apoptotische Signale vermittelt. Die p70S6K phosphoryliert das ribosomale, im Cytoplasma lokalisierte Protein S6 und ist somit an der Translationskontrolle beteiligt. Mittels Immunfluoreszenzanalysen konnte der p70S6K eine Lokalisation im Cytoplasma und bei Cytokin- stimulierten Zellen im Kern zugeordnet werden. Die Verteilung der p70S6K auf die beiden Zellkompartimente ließen vermuten, dass diese Kinase neben S6 noch weitere Liganden hat. Um dieser Hypothese nachzugehen, wurde eine HeLa cDNA-Genexpressionsbank im Yeast Two-Hybrid System gescreent. Dabei konnte Tumor Nekrose Faktor Rezeptor-assoziierter Faktor 4 (TRAF4) als neuer Ligand der p70S6K identifiziert werden. Nach Transfer von Expressionsplasmiden in humane Zellen wurde die im Hefesystem detektierte Interaktion durch Coimmunpräzipitationen bestätigt. Aus funktionalen Analysen wurde deutlich, dass HEK-293 Zellen, die kein endogenes TRAF4 exprimieren, nach TNF Stimulation nicht mit der Aktivierung der p70S6K und anschließender Phosphorylierung von S6 reagierten, während dies für TRAF4 transfizierte Zellen zutraf. Damit wurde gezeigt, dass vom TNF- Rezeptor ausgehende Signale über TRAF4 zur Aktivierung der p70S6K führen. Die p70S6K/TRAF4-Interaktion stellt demnach eine neue Verbindung zwischen zwei bisher voneinander unabhängigen Signaltransduktionswegen her.

In this work the influence of cytokine-induced signalling on proliferation of hematopoietic cells was studied. The use of specific kinase inhibitors in [3H]-thymidine incorporation assays showed that both the PI3K/p70S6K and the Ras/Raf/MAPK pathways, play critical roles in cytokine-induced proliferation as well as in antiapoptotic signalling. p70S6K mediates phosphorylation and activation of its main substrate, the ribosomal S6 protein, which controls the translational apparatus. Immunofluorescent staining showed that the p70S6K is localized both in the cytosol and, after activation, also in the nucleus. The nuclear localization of p70S6K leads to the hypothesis that the p70S6K might interact with additional elements other than its known cytosolic partners, for example with a transcription factor. Using the p70S6K as bait in a yeast two-hybrid screen tumor necrosis factor receptor- associated factor 4 (TRAF4) was identified as a new ligand of this enzyme. In order to confirm these results, HEK-293 cells were co-transfected with expression vectors. First, the p70S6K/TRAF4 interaction identified by yeast two-hybrid screening was corroborated via coimmunoprecipitation assays. Functional analyses showed, that TNF did not lead to activation of p70S6K in HEK-293 cells, which lack endogenous TRAF4 expression. In contrast, TRAF4 transfectants showed a strong increase of p70S6K activity upon stimulation with TNF. These results support the notion that TRAF4 is involved in signalling by receptors of the TNF receptor family leading to activation of the p70S6K. Our data further imply the existence of crosstalk between TNF receptor signalling and p70S6K activity.

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Fleckenstein, Diana Silke: Charakterisierung Cytokin-induzierter Signaltransduktionswege : TNF-Rezeptor assoziierter Faktor 4 (TRAF4) als neuer Ligand der p70S6 Kinase. 2002.

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