Entwicklung regulierbarer retro- und adenoviraler Vektoren für die Gentherapie

Unsinger, Jacqueline

Die Möglichkeit, die Expression von Genen zu regulieren, ist sowohl in der Forschung als auch in der Gentherapie ein wünschenswertes Ziel. Jedoch unterliegt die Regulation der Limitation, dass alle regulierbaren Expressionssysteme aus zwei Komponenten bestehen, dem Transaktivatorprotein (tTA) und dem tTA-abhängigen Promotor, die in die Zielzellen transferiert und adequat exprimiert werden müssen. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene autoregulative Expressionskassetten basierend auf dem tet-regulierten System entwickelt. Diese Kassetten wurden so konstruiert, dass sie alle Regulationskomponenten beinhalten und so in einem Schritt transferiert werden können (Single- Step-Systeme). Durch die autoregulative Anordnung des tTA's bleibt seine Expression auf die Phase der Geninduktion beschränkt. Toxische Nebenwirkungen werden so minimiert. Diese Kassetten wurden über Elektrotransformation sowie über retro- und adenovirale Infektion in die Zielzellen eingebracht und das jeweilige Expressions- und Regulationspotential ermittelt. Im Gegensatz zur unidirektionalen Expressionseinheit, boten die autoregulativen bidirektionalen Expressionssysteme nach jedem für die Gentherapie relevanten Transfer hohe und stabile Regulationskapazität des interessierenden Gens. Durch die Konstruktion chimärer retro-/adenoviraler Vektoren wurden Viren generiert, deren Charakteristika eine Kombination der positiven retro- und adenoviralen Eigenschaften darstellen. So war es möglich die effiziente Transduktion der Adenoviren mit der stabilen Intergration der Retroviren zu kombinieren. Dieses chimäre System könnte sich daher zu einem relevanten System in der Gentherapie entwickeln.

Regulated transgene expression is increasingly used in research but is also a need for certain therapies. Regulatory systems are usually composed of two expression units, one bearing the gene of interest under the control of a regulatable promotor, the second a constitutively expressed transactivator (tTA) which modulates activity of the regulatable promotor. Since the cotransfer of two independent elements is not efficient in primary cells single transduction step vectors conferring regulatable gene expression cassettes would be of advantage. In the present work different autoregulatable expression cassettes based on the tet-regulatable system were designed. These expression cassettes encode all components necessary for regulated gene expression and can therefore be transferred in a single transduction step (single- step systems). Due to the autoregulative arrangement of the tTA, toxic side effects were limited to the time of the induced gene expression. These cassettes were transferred to the target cells both via electrotransformation and retro- and adenoviral infection. The expression- and regulation potential was determined. In contrast to the unidirectional expression unit, the bidirectional expression system offered high and stable regulation capacity of the gene of interest independent of the transfer system used. The construction of chimeric retro-/adenoviral vectors generated viruses, that possess the positive characteristics of both virus types, the high transduction efficiency of adenoviruses and the stable integration of retroviruses. This chimeric system might evolve to a relevant transfer system in gene therepy applications.

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Unsinger, Jacqueline: Entwicklung regulierbarer retro- und adenoviraler Vektoren für die Gentherapie. 2001.

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