Die Funktionen von Profilin und Ena/VASP-Proteinen in der intrazellulären Motilität von Listeria monocytogenes

Geese, Marcus

Die intrazelluläre Motilität des bakteriellen Pathogens Listeria monocytogenes dient als Modellsystem zur Studie Aktin-vermittelter Motilität in eukaryotischen Zellen. Listerien induzieren die Aktinfilamentpolymerisation durch Rekrutierung von Wirtszellproteinen, um sich durch das Zytoplasma zu bewegen. In dieser Arbeit wird die Rolle von Profilin und Ena/VASP-Proteinen (EVP) in der Listerienmotilität untersucht. GFP (grün fluoreszierendes Protein) markiertes Profilin und EVP wurden zur Analyse ihrer Dynamik in Listerien-infizierten Zellen mittels Videomikroskopie verwendet. Retroviraler Gentransfer GFP-markierter EVP wurde durchgeführt, um die Listerienmotilität in EV-freien Zellen zu rekonstituieren. Durchflußzytometrie erlaubte die Kontrolle der Expressionsrate der EVP zur Quantifizierung der Auswirkungen von EV-Mutationen. Die Ergebnisse zeigten, dass Prolin-reiche Regionen innerhalb der EVP für die Rekrutierung von Profilin zu motilen Listerien verantwortlich sind. Die Menge rekrutierten Profilins korrelierte mit der listeriellen Geschwindigkeit. Die Deletion dieser Domänen reduzierte die Geschwindigkeiten drastisch, während die Deletion einer potentiellen Aktinmonomerbindungsdomäne die Motilität leicht verringerte. Die Störung der EV-Aktinfilamentbindung und -Multimerisierung sowie die simulierte EV-Phosphorylierung steigerte die Listerienmotilität. Somit integrieren EVP in vivo multiple Funktionen in der Aktinpolymerisation, die zudem durch Phosphorylierung reguliert werden können.

The intracellular motility of the bacterial pathogen Listeria monocytogenes serves as a model system to study actin based motility in living eucaryotic cells. To propel themselves through the cytoplasm Listeria trigger the polymerisation of actin filaments by recruiting host cell proteins. This work focuses on the role of the host cell factors profilin and Ena/VASP proteins in Listeria motility. GFP (green fluorescent protein) tagged profilin and Ena/VASP proteins were utilised to analyse their dynamics in Listeria infected cells using video microscopy. Retroviral gene transfer was performed to express GFP-Ena/VASP proteins and thus reconstitute Listeria motility in Ena/VASP free cells. Flow cytometry was used to control the expression rate of the GFP-Ena/VASP proteins in order to quantify the effects of mutated Ena/VASP proteins. The results showed that proline-rich regions within the Ena/VASP proteins are responsible for the recruitment of profilin to motile Listeria. The amount of recruited profilin correlated with the speed of Listeria. The deletion of this domain decreased Listeria speed dramatically whereas the deletion of a putative Ena/VASP actin monomer binding domain reduced motility slightly. Interference with Ena/VASP actin filament binding and multimerisation increased Listeria motility as did mimicking Ena/VASP phosphorylation. Thus, in vivo the Ena/VASP proteins integrate multiple functions in actin polymerisation which in addition can be regulated by phosphorylation.

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Geese, Marcus: Die Funktionen von Profilin und Ena/VASP-Proteinen in der intrazellulären Motilität von Listeria monocytogenes. 2001.

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