Isolierung und funktionelle Charakterisierung Histon-ähnlicher Proteine aus Pseudomonas putida : in vitro-Untersuchungen zur Rolle von HU und IHF bei der Aktivierung Sigma-54-abhängiger Promotoren des TOL-Plasmids

Bartels, Frank

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, erstmalig ein aus Proteinkomponenten von Pseudomonas putida bestehendes in vitro-Transkriptionssystem zu etablieren, mit dem spezifische Fragen zur Ko-Aktivierung der Sigma-54-abhängigen Promotoren Pu und Ps1 des TOL-Plasmids aus P. putida durch die Histon-ähnlichen Proteine IHF und HU untersucht werden sollten. Hierzu wurden die an der Aktivierung dieser Promotoren beteiligten Proteine IHF, HU, Sigma-54 und RNA-Polymerase-Core-Enzym aus P. putida aufgereinigt und teilweise charakterisiert. Zunächst wurde festgestellt, daß P. putida zwei Gene, hupB und hupN, die für HU codieren, besitzt, welche gleichermaßen eine HU-Mutante komplementieren konnten. In hupB- bzw. hupN-Deletionsmutanten wurde nur im Fall von hupB ein signifikanter Einfluß auf die Ps1-Aktivität festgestellt. Der Verlust beider Gene ist dagegen letal. Die biochemische Charakterisierung von HupB und HupN aus P. putida zeigte, daß beide Proteine jeweils Dimere bilden und HU-typische Aktivität, jedoch unterschiedliche Kinetiken aufweisen. Mit Hilfe des etablierten in vitro-Transkriptionssystems wurde festgestellt, daß sowohl HupB als auch HupN in der Lage ist, die Aktivierung von Pu und Ps1 zu stimulieren, wobei sich allerdings HupN als effektiver herausstellte. Die Aktivierung von Pu erwies sich in Anwesenheit von IHF und HupB/HupN zusammen als maximal. Weiterhin stellte sich der Promotor Ps1 im Vergleich zu Pu in vitro als der deutlich temperaturabhängigere heraus.

The aim of the work was to establish an in vitro transcription system consisting exclusively of proteins from Pseudomonas putida to study specific aspects of co-activation of the sigma 54-dependent promoters Pu and Ps1 of the TOL plasmid of P. putida by the histone-like proteins IHF and HU. To this end proteins involved in the activation of both promoters, IHF, HU, sigma 54 and RNA polymerase, were purified from P. putida and were partially characterised. Cloning of the gene coding for HU in P. putida led to the identification of two distinct genes, hupB and hupN, which fully complemented a Bacillus subtilis HU mutant. Ps1-activity measured in hupB and hupN deletion mutants of P. putida was significantly decreased only in the hupB mutant. A hupB/hupN double deletion mutant could not be obtained since the absence of both gene products was found to be lethal. The biochemical characterisation of HupB and HupN showed that both proteins formed mainly dimers and that in recombination assays they exhibit HU-like activity but with different kinetics. The purified proteins were used in a in vitro transcription assay which showed that HupB as well as HupN is able to stimulate the activation of both Pu and Ps1 promoters while HupN was found to be more active. Activation of the Pu promoter was higher in the presence of IHF and HupB/HupN than with IHF or HupB/HupN alone. Furthermore, in vitro Ps1 was found to be more temperature-dependent than Pu.

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Bartels, Frank: Isolierung und funktionelle Charakterisierung Histon-ähnlicher Proteine aus Pseudomonas putida : in vitro-Untersuchungen zur Rolle von HU und IHF bei der Aktivierung Sigma-54-abhängiger Promotoren des TOL-Plasmids. 2001.

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