Embryonale Expressionsanalyse und genomische Charakterisierung des NRF-Gens

Schwarzer, Michael

In dieser Arbeit wurde NRF, ein Repressor der NF-kappaB Aktivität, in der Maus analysiert. Dafür wurde das murine NRF-Gen isoliert und charakterisiert. Das embryonale Expressionsmuster wurde bestimmt, sowie die genomische Organisation und Lokalisierung festgestellt. Der Effekt des Fehlens von NRF wurde in Zellkultur untersucht. Zur Herstellung einer Null-Mutation wurde ein Zielvektor konstruiert und mutierte ES-Zellen hergestellt. Murine NRF cDNA wurde mit Hilfe des humanen NRF-Gens identifiziert. Diese cDNA diente zur Erkennung der genomischen DNA die das NRF-Gen enthält und zur Bestimmung des embryonalen Expressionsmusters durch 'whole-mount-in-situ-Hybridisierung'. Die Expression von NRF wurde in ES-Zellen und in Embryonen ab Tag 7,5 nachgewiesen. Sie konnte in der Embryogenese vorwiegend im Hirn, den Hinterwurzelganglien und den Extremitäten identifiziert werden. Dabei tritt als erstes (ab Tag10,5) Expression in den Hinterwurzelganglien auf. Die NRF Expression im Hirn konnte ebenso wie Expression in den Extremitäten ab Tag 11,5 nachgewiesen werden. In den Extremitäten erstreckt sich NRF-Expression um die Zonen der beginnenden Knorpelkondensation und in den Zehenzwischenräumen. Damit wurde NRF-Genexpression in Bereichen die vorwiegend Nervenzellen enthalten gefunden aber ebenso in Bereichen in denen in den Extremitäten Apoptose stattfindet. Die Derepression des Interferon-beta Promotors durch Expression von NRF-antisense RNA führt zur Produktion von Interferon und gleichzeitig zu einer erhöhten Sterberate von Zellen in Kultur. Die genomische Charakterisierung ergab eine große Homologie von 90 in der Proteinsequenz, ebenfalls 90 Homologie in der Sequenz der 3'UTRs und 78 Homologie der 5'UTRs. NRF wurde auf dem X-Chromosom kartiert und liegt dort in der A4 Region. Genauere Aussagen über die Funktion von NRF können aus einer konditionalen Null-Mutation gewonnen werden die in dieser Arbeit vorbereitet wurde.

NF-kappaB/rel proteins are present in most cell types. In concert with other transcriptional factors they regulate a variety of genes which contribute to a wide spectrum of physiological activities like inflammation and apoptosis. In this work NRF known as a transcriptional repressor of NF-kappaB was analyzed in the mouse. For this purpose the murine NRF gene was isolated and characterized. The expression pattern in the embryo was determined and the genomic organisation and localisation estimated. In order to allow the knock out a targeting vector was constructed and recombined ES-cells produced. The murine NRF cDNA was identified by hybridization with the human NRF. The cDNA was used to find the genomic DNA fragment containing NRF and to determine the embryonic expression pattern by `whole-mount-in-situ-hybridization´. Expression of NRF was shown in embryonic stem cells and in the embryo from embryonic day 7,5 on. In embryogenesis NRF could be identified in brain, dorsal root ganglia and limbs, starting with expression in dorsal root ganglia at day 10,5. In the brain and the limbs NRF was detected from day 11,5 on. Expression in the limbs was shown in the interdigital zones an around zones where condensation of cartilage occurs. NRF expression was shown to be prominent in zones where neural cells were found, but also in regions of the limbs where apoptosis occurs. Expression of NRF antisense RNA in culture conducts to the derepression of the interferon-beta promoter and to an elevated death rate of the cells. With the genomic characterization murine NRF could be compared with the human gene. There were homologies found which are as high as 90 for the protein, 90 in the 3'-UTR and 78 in the 5'-UTR. Chromosomal localisation of NRF has shown NRF to be in the A4 region of the X-chromosome. More knowledge about the function of NRF should come from the conditional knockout prepared in this work.

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Schwarzer, Michael: Embryonale Expressionsanalyse und genomische Charakterisierung des NRF-Gens. 2001.

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