Identifizierung und Charakterisierung von regulativen Interaktionspartnern der Glucokinase in der beta-Zelle des Pankreas und der Leber

Baltrusch, Simone Erika

Die Glucokinase (GK) ist das Schlüsselenzym der glucoseinduzierten Insulinsekretion in den beta-Zellen des Pankreas und des Glucosemetabolismus in der Leber. Translokationsprozesse stellen sowohl in der Leber als auch in der beta-Zelle ein posttranslationales GK-Regulationsprinzip dar. Während in der Leber mit dem Glucokinase-Regulatorprotein (GRP) ein spezifischer Interaktionspartner identifiziert wurde, ist der Mechanismus der GK-Bindung in der ß-Zelle des Pankreas bislang unklar. Zudem fehlen molekulare Detailkenntnisse über die Natur der GK-GRP Interaktion. In der vorliegenden Dissertation konnten durch ein systematisches Screening einer Phage Display Random-Peptide Library spezifische Bindungsepitope (1) des GRP der Leber und (2) des bifunktionellen Enzyms 6-Phosphofructo-2-kinase/Fructose-2,6-bisphosphatase (PFK2) als GK Interaktionspartner identifiziert werden. Durch Hefe Two Hybrid Studien und in vitro Bindungsassays konnte gezeigt werden, daß die GK-PFK2 Interaktion über ein Bindungsepitop der Fructose-2,6-bisphosphatasedomäne vermittelt wird. Diese erstmalig beschriebene Interaktion zwischen der GK und der in den ß-Zellen nachweislich exprimierten PFK2 könnte sich im Sinne eines Metabolic Channeling in das Prinzip der Stimulus-Sekretionskopplung der ß-Zelle integrieren. Im ermittelten Bindungsepitop des GRP konnten durch Mutationsanalysen und Two Hybrid Studien die Aminosäuren Ser-182, Val-186 und Ala-187 als primäre GK Bindungsresiduen charakterisiert werden. Als komplementäres Bindungsepitop der GK konnte ein Asparagin-Leucin Motiv im Phage Display Experiment ermittelt und damit die Bindungseigenschaften des GK-GRP Komplexes detaillierter bestimmt werden.

Glucokinase (GK) plays a pivotal role in the process of glucose recognition in pancreatic beta cells and of glucose metabolism in liver. Translocation is a key mechanism of posttranslational GK regulation in liver as well as in pancreatic beta cells. While in liver GK is modulated through an interaction with a regulatory protein (GRP) a comparable principle of GK regulation in beta cells is as yet unknown. Also the molecular aspects of the GK-GRP interaction are not known. In this work a phage display random peptide library was screened for binding partners of GK. Two proteins showed a strong GK interaction: 1. The GRP of the liver and 2. The bifunctional glycolytic enzyme 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6 bisphosphatase (PFK2). Binding studies and yeast two hybrid assays revealed that the interaction of GK with PFK2 is mediated by the fructose-2,6-bisphosphatase domain. This for first time described interaction of GK with PFK2 may provide a possible mechanism of GK regulation in pancreatic beta cells through formation of a multienzyme complex which may have a significant impact on stimulus-secretion coupling. Mutation analysis and two hybrid assays showed that in the GRP binding motif the residues Ser-182, Val-186 and Ala-187 of GRP are of functional importance for binding to GK. An asparagine-leucine consensus motif was identified by phage display library screenings as the complementary GK binding sequence and contributes to the understanding of the molecular aspects of GK-GRP interaction.

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Baltrusch, Simone Erika: Identifizierung und Charakterisierung von regulativen Interaktionspartnern der Glucokinase in der beta-Zelle des Pankreas und der Leber. 2000.

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