Nachweis biologisch aktiver Wachstumsfaktoren mit Hilfe von Rezeptorproteinen

Tiedemann, Birgit von

Die biotechnologische Herstellung pharmazeutisch wirksamer Proteine gewinnt zunehmend an Bedeutung. Von Interesse sind dabei Wachstumsfaktoren, die sich direkt oder indirekt als Humantherapeutika verwenden lassen. In der Forschung werden mit ihnen zelluläre Prozesse und damit verbundene Krankheiten untersucht. Von großem Interesse sind der angiogene Wachstumsfaktor VEGF und seine Rezeptoren KDR und FLT-1. Um rekombinant hergestelltes VEGF nutzen zu können, muß es in seiner biologisch aktiven Form vorliegen. Bisher werden aufwendige radioaktive Zellassays zur Überprüfung der Qualität genutzt. Da die Erkennung des Wachstumsfaktors über FLT-1 und KDR erfolgt, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob sich die löslichen Rezeptorproteine (sFLT-1, sKDR) für den Nachweis von aktivem VEGF eignen. Untersuchungen zur Affinität zeigten, daß sich vor allem sFLT-1 für den Aufbau einer sensitiven Nachweismethode eignet. In Analogie zu bekannten Immunoassayformaten wurden verschiedene indirekte Rezeptorassays basierend auf Mikrotiterplatten konzipiert. So wurde eine kompetitive Nachweismethode mit einem VEGF-POD-Konjugat sowie unterschiedliche Rezeptorassays im Sandwichformat mit den entsprechenden Anti-VEGF-Antikörpern entwickelt. Neben diesen indirekten Formaten wurde auch das BIAcore-System als direkter Affinitätssensor verwendet. Mit Hilfe der entwickelten Rezeptorassays war die Quantifizierung von aktivem VEGF in verschiedenen Realproben problemlos möglich.

The biotechnological production of pharmaceutically relevant proteins becomes more and more important. Recombinant growth factors can be used directly or indirectly to treat different diseases. With their help cellular processes and diseases can be studied. Due to its angiogenic effect VEGF and its receptor proteins KDR and FLT-1 are of special interest. Recombinantly produced VEGF has to be biolocially active. Up to now expensive radioactive assays based on cells are used to check its quality. As VEGF is recognised by FLT-1 and KDR, the aim of this thesis was to evaluate the possibility of usage of soluble receptor proteins (sFLT-s, sKDR) for acticity studies and in detection methods. Analogous to well-known immuno assay formats different indirect receptor assays based on microtiter plates had been considered. Thus a competitve assay using a VEGF-POD conjugate was tested. Several receptor assays using a sandwich format based on different antibodies were established. Based on the BIAcore system a direct affinity sensor was developed. All these receptor assays can be used to detect biolocially active VEGF.

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Tiedemann, Birgit von: Nachweis biologisch aktiver Wachstumsfaktoren mit Hilfe von Rezeptorproteinen. 2000.

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