Untersuchungen zur Wechselwirkung von Listeria monocytogenes mit Komponenten des Mikrofilamentsystems der Wirtszelle und funktionelle Charakterisierung des Aktin-Nukleationsfaktors ActA

Gröbe, Lothar

Der intrazelluläre Krankheitserreger Listeria monocytogenes kann die lebensbedrohende Listeriose verursachen. Mit dem Aktin-Nukleationsfaktor ActA induzieren diese Bakterien die Polymerisierung von Aktin an ihrer Oberfläche, um sich intra- und interzellulär zu verbreiten. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Interaktion von ActA mit wichtigen Komponenten des Aktinsystems der Wirtszelle bearbeitet. 1) Nach Immunodepletion von VASP aus Thrombozytenextrakten waren die Listerien nicht mehr motil. Die EVH1-Domäne von VASP, Mena und Evl inhibierte die Fortbewegung der Bakterien in dem zellfreien System. Damit konnte erstmals die direkte Beteiligung von VASP an der Fortbewegung der Listerien nachgewiesen werden 2) Mit Hilfe polyklonaler und monoklonaler Antikörper gegen p21-Arc konnte der Arp2/3-Komplex in infizierten Gewebekulturzellen auf der Oberfläche stationärer und im Aktinschweif motiler Listerien lokalisiert werden. Die Rekrutierung des Arp2/3-Komplexes war unabhängig von existierenden Aktinfilamenten, da p21-Arc auch nach Zerstörung der Aktinfilamente durch Latrunculin B noch auf der Listerienoberfläche nachgewiesen werden konnte. 3) Durch gezielte Mutagenese des KKRRK-Motivs wurde ActA charakterisiert. Die Analyse im Mitochondrien-Targetingsystem und die Charakterisierung isogener Listeria-Mutanten konnte zeigen, daß die zwei Argininreste an Position 148 und 149 für die Aktinnukleation und die Rekrutierung des Arp2/3-Komplexes essentiell waren. Die erzielten Resultate lieferten neue Erkenntnisse über die Wechselwirkung des ActA-Proteins mit dem Mikrofilamentsystem der Wirtszelle, und es wurde ein verbessertes Dreistufenmodell für die Nukleation von Aktinfilamenten durch intrazelluläre Listerien vorgestellt.

The intracellular pathogen Listeria monocytogenes is causing the life threatening disease Listeriosis. With the actin nucleating factor ActA Listeria induce the polymerization of actin at their surface for intra- and intercellular spreading. The work presented here is dealing with different aspects of the interaction of ActA with the microfilament system. 1) After immunodepletion of VASP from platelet extracts, Listeria were no longer able to move. The EVH1-domain of VASP, Mena and Evl inhibited listerial movement in a cell free system. This was the first evidence for a direct implication of VASP in listerial movement. 2) With polyclonal and monoclonal antibodies against p21-Arc was the Arp2/3-complex localized on the surface of stationery and in the actin tail of moving Listeria. Recruitment of the Arp2/3-complex was independent of preexisting actin filaments, since after destruction of filaments with Latrunculin B, p21-Arc was still detectable on the surface of Listeria. 3) ActA was characterized by site-directed mutagenesis of the KKRRK motiv. Analysis in the mitochondria targeting system and characterization of isogenic Listeria-mutants could show, that the two Arginin residues at positions 148 and 149 are essentiell for actin filament nucleation and recruitment of the Arp2/3-complex. These results revealed new insight into the interaction of the ActA protein with the microfilament system of the host cell and a refined three-step-model for the nucleation of actin filaments by intracellular Listeria is presented.

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Gröbe, Lothar: Untersuchungen zur Wechselwirkung von Listeria monocytogenes mit Komponenten des Mikrofilamentsystems der Wirtszelle und funktionelle Charakterisierung des Aktin-Nukleationsfaktors ActA. 2000.

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