Untersuchungen zum Nachweis von Phosphorylierungen an Proteinen und Peptiden mit Eisen(III)-(N-ethyliminodiessigsäure-N'-fluorescein-thioharnstoff)

Klein, Adrian

Eisen(III)-Chelate binden phosphorylierte Proteine und Peptide relativ spezifisch. In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur Nutzung von Eisen(III)-Iminodiessigsäure-Fluorescein (FIF) für die Färbung von Proteinblots und Peptidembranen und mit der Kapillarelektrophorese (CE) durchgeführt. In 50mM MES-Puffer pH 6,0 und 1M NaCl konnten bei 60-80°C über 30 min Proteine auf Nitrocellulose gefärbt werden. In der CE konnten mit dem Farbstoff nicht phosphorylierte von phosphorylierten Proteinen unterschieden werden. Aufgrund unflexibler Bedingungen und hoher notwendiger Proteinkonzentrationen erscheint eine Anwendung nicht sinnvoll. Peptidmembranen wurden einem Phosphorylierungsassay mit dem immunopräzipitierten Interleukin-1-Rezeptor I - Komplex unterzogen und konnten dann mit FIF markiert werden. Durch In-Gel-Regenerierung wurde zuvor nachgewiesen, daß zwei bis drei autophosphorylierende Kinasen darin zu finden sind. Für die Untersuchung der Färbespezifität von FIF wurden Peptidmembranen verwendet. FIF erwies sich in bezug auf die Färbung von Phosphoproteinen oder -peptiden als nicht sehr spezifisch. Für spezielle Anwendungen wie Phosphorylierungsassays mit geeigneten Peptiden könnte es dennoch nützlich sein. Im Anschluß an die Experimente wurde eine Färbetheorie entwickelt. Die Zugänglichkeit der Phosphatgruppe ist offenbar wichtig für die Bindung von FIF. Der pH-Wert beeinflußt zwei Effekte gegensätzlich. Ein hoher pH-Wert führt zu schlechter Farbstoffbindung - vermutlich, weil die [OH-]-Ionen an das Eisen(III)-Chelat binden. Ein niedriger pH-Wert mindert die Fluoreszenzintensität stark, vermutlich durch nicht fluoreszente Isoformen des Fluorescein.

Iron(III) chelates bind phosphorylated proteins and peptides with a certain specificity. In this work some investigations were made concerning the use of iron(III)-iminodiacetate-fluorescein (FIF). At first conditions were tested for proteins on membranes. By using 50mM MES-buffer, pH 6.0 with 1M NaCl sufficient results were obtained in 30 min at 60-80?C with nitrocellulose. In parallel FIF was used with capillary electrophoresis. A phosphorylated and a nonphosphorylated protein could be distinguished but with low practical use due to poor flexibility of the conditions and the need of high protein concentration. Then Peptides synthesized on cellulose membranes in a phosphorylation assay with the immunoprecipitated receptor I complex of interleukin-1 were used. Beforehand it was proved by in gel regeneration that two or three self phosphorylating kinases can be found in the immunoprecipitate. The peptides could also be marked with FIF. For further investigations of the colouring specificity of FIF a peptide membrane was designed and coloured. It became obvious that FIF can not be seen as highly specific concerning colouring of phosphorylated peptides or proteins. But for certain applications such as phosphorylation assays with qualified peptides it might be useful. After the practical work a colouring theory was developed. Obviously the accessibility of the phosphate group is of importance. The pH value influences two effects contraryly. On the one hand a high pH leads to low binding of FIF. This is probably because the [OH-]-ions can bind to iron(III) chelate. On the other hand the fluorescence intensity is weak at a low pH, probably caused by nonfluorescing isoforms of fluorescein which are more probable at a lower pH due to its charge.

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Klein, Adrian: Untersuchungen zum Nachweis von Phosphorylierungen an Proteinen und Peptiden mit Eisen(III)-(N-ethyliminodiessigsäure-N'-fluorescein-thioharnstoff). 2000.

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