Glykodesign und Herstellung sicherer Verpackungszellinien zur Erzeugung rekombinanter, serumstabiler Retroviren für die Gentherapie

Hansen, Wiebke

Retrovirale Vektorsysteme spielen in der ex vivo Gentherapie eine große Rolle. Für in vivo Applikationen ergeben sich jedoch noch Probleme hinsichtlich der biologischen Sicherheit und Stabilität in humanem Serum. Die Inaktivierung rekombinanter Retroviren aus Mauszellen in humanem Serum ist auf die Interaktion des Gal-a-1,3 Gal Epitops der viralen Hüllproteine mit den im humanem Serum zirkulierenden Antikörpern gegen diese Kohlenhydratstruktur zurückzuführen. Zur Erzeugung serumstabiler Retroviren wurde zum einen das Glykosylierungspotential muriner Verpackungszellen durch Enzymkompetition modifiziert. Die Expression der chimären ft1ST3-Glykosyltransferase (CTS-Region der a-1,2 Fucosyltransferase; katalytische Domäne der a-2,3 Sialyltransferase III) führte zu einer deutlichen Reduktion der Synthese des Gal-Epitops, sowie zu einer 3,5 fachen Erhöhung der Serumstabilität der Retroviren aus diesen modifizierten Zellen. Zum anderen wurde eine neuartige BHK21B Verpackungszelle entwickelt, die sich durch eine fehlende a-1,3 Galaktosyltransferaseaktivität auszeichnet, so dass die freigesetzten Retroviren sich durch eine nahezu 100 ige Stabilität in humanem Serum auszeichnen. Weiterhin zeigen die endogenen, retroviralen Sequenzen dieser Zellinie keine Homologie zu den MLV abgeleiteten Verpackungsfunktionen bzw. Vektoren, so dass das Sicherheitsrisiko der Bildung replikationskompetenter Retroviren durch homologe Rekombinationen deutlich verringert werden konnte.

Although retroviral vector systems play an important role in ex vivo gene therapy, for in vivo applications there are still some problems concerning their biological safety and stability in human sera. The viral env proteins released from murine packaging cell lines are decorated with N-glycans containing the gal-a-1,3 gal epitop. The interaction of this carbohydrate structure with antibodies circulating in human blood leads to the activation of complement followed by the lysis of these retroviruses. For generation of serum stabilized retroviral vectors the glycosylation pattern of the murine derived PA317 packaging cell line was modified by specific enzyme competition. The expression of a chimera ft1ST3- glycosyltransferase (CTS-region of a-1,2 fucosyltransferase; catalytic domain of a-2,3 sialyltransferase III) leads to a decrease in gal-epitop synthesis and to a 3.5 fold increase in serum stability of retroviruses released from these cells. Using another approach a new BHK21B packaging cell line was generated, which doesn`t express a functional a-1,3 galactosyl-transferase at all. Retroviral vectors produced by this cell line show an almost 100 stability in human sera. Furthermore, the endogenous retroviral sequences of these cells show no homology to MLV derived packaging functions and vectors, i.e. the risk of generation of replication-competent retroviruses by homologous recombination is minimized and the biological safety is increased.

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Hansen, Wiebke: Glykodesign und Herstellung sicherer Verpackungszellinien zur Erzeugung rekombinanter, serumstabiler Retroviren für die Gentherapie. 2000.

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