Untersuchung der induzierten Proteinproduktion unter Kontrolle des Glucoamylasepromotors in Aspergillus niger bei Verwendung des fluoreszierenden Reporterproteins S65TGFP

Ganzlin, Markus

Das in Aspergillus niger produzierte Enzym Glucoamylase wird von der Zuckerindustrie häufig verwendet. Für die Genexpression in Aspergillus wird der A. niger-Glucoamylase-Promotor (glaA-Promotor) bevorzugt eingesetzt. In dieser Arbeit wurde die Regulation der glaA-Genexpression auf Transkriptionsebene mit Hilfe eines Modellsystems untersucht. Dabei wurde eine Mutationsform (S65TGFP) des fluoreszierenden Reporterproteins GFP ('green fluorescent protein') unter der Kontrolle des glaA-Promotors in A. niger produziert. Für diese Untersuchung wurde ein Screening-Verfahren entwickelt. Die Repression der glaA-kontrollierten Genexpression durch Xylose wurde nachgewiesen. Bei Wachstum auf Glucose und Kohlenstoffquellen mit a?1,4?glykosidisch gebundenen Glucoseeinheiten (Maltodextrin, Maltose, Maltotriose, Amylose) erfolgte eine Induktion der S65TGFP-Synthese. 2?Deoxyglucose erwies sich als nicht metabolisierbarer Induktor. Bei hohen Konzentrationen dieses Analogs der D?Glucose wurde eine Kohlenstoff-Repression festgestellt. Eine Proteinproduktion mit induzierter Produktbildung wurde mittels Fed-Batch-Kultivierungstechnik erreicht. Dabei wurde die S65TGFP-Produktion nach Wachstum auf Xylose (Batch-Phase) durch Zufütterung von Maltose induziert. Wachstumslimitierende Maltosezufütterung führte zu einer höheren Induktionseffizienz als Maltose-Überschuss-Zufütterung. Die S65TGFP-Produktion konnte mit Hilfe der in-situ-2D?Fluoreszenzspektroskopie in Echtzeit online verfolgt werden. Die spezifische S65TGFP-Konzentration war von der Pelletgröße abhängig. Mit Abnahme der Pelletgröße erhöhte sich die spezifische S65TGFP-Konzentration.

The enzyme Glucoamylase, produced in Aspergillus niger, is frequently used in the sugar industry. The glucoamylase-promotor (glaA-promotor) of A. niger is favoured for gene-expression in Aspergillus. In this thesis the glaA-Genregulation on transcription level was studied, using a model system. A mutant form (S65TGFP) of the fluorescent reporter protein GFP (green fluorescent protein) was produced under control of the glaA-promotor. For this investigation a screening method was developed. Repression of the glaA-controlled gene-expression by Xylose was demonstrated. When A. niger was grown on glucose and carbon sources with a?1,4?linked glucose units (maltodextrin, maltose, maltotriose, amylose) synthesis of S65TGFP was induced. 2?Deoxyglucose acted as a non-metabolizable inducer. Carbon repression was demonstrated at high concentrations of this analogue of D?glucose. Protein production with induced product formation was achieved using fed-batch cultivation techniques. After growth on xylose (batch-phase), induction was accomplished by maltose feeding. The growth-limiting addition of maltose resulted in more efficient induction than excess maltose feeding. Online-monitoring of the production of S65TGFP in real time was demonstrated using in-situ-2D?fluorescence spectroscopy. Specific S65TGFP-concentration of pellets was shown to depend on pellet size. With decreasing pellet size, specific S65TGFP-concentration increased.

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Ganzlin, Markus: Untersuchung der induzierten Proteinproduktion unter Kontrolle des Glucoamylasepromotors in Aspergillus niger bei Verwendung des fluoreszierenden Reporterproteins S65TGFP. 2000.

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