Isolation of high affinity ligands against SH3 and EVH1 domains using the phage display cosmix-plexing technology

Horn, Nathalie

Phage display stellt eine Technik dar, mit der Peptide am Oberfläche des Phagen exprimiert werden. Eine neue Phage display Strategie, cosmix-plexing, erlaubt die Isolation hoch affiner Liganden. Cosmix-plexing erlaubt die Rekombination in hypervariablen DNA Regionen. Dazu ist ein Restriktionsenzym vom Typ IIs erforderlich, das an eine definierte DNA Sequenz bindet, aber in einem festgelegten Abstand dazu schneidet. Die Rekombination der rechten und linken Spaltstücke der hypervariablen Domänen ist möglich, und erlaubt die original Diversität zu steigern, oder die Affinität von einer preselektierten Population zu optimieren. Eine Ziel gerichtete cosmix-plexing Bibliothek für SH3 Domänen wurde generiert, die drei Prolin an definierten Positionen beinhaltet, da SH3-Domänen vorwiegend an Prolin reiche Liganden binden. EVH1 Domänen binden sich ähnlich, deshalb wurden auch sie untersucht. Liganden mit hoher Affinität konnten mit einer cosmix-plexing Bibliothek isoliert werden. BIAcore Analysen für diese SH3 Liganden zeigten KD im nM-Bereich, d.h. sie besitzen tausendfach höhere Affinität zu SH3-Domänen, als die bisher beschriebenen SH3-Liganden. Die Funktion von SH3 Domänen in Signaltransduktions-Kaskaden kann untersucht werden, in denen natürliche SH3-Liganden in vivo kompetitieren. Vorläufige Experimente, in denen cosmix-plexing SH3 Peptide mit Hilfe des Tat-fusion protein transduction systems in lebende Zellen eingebracht wurden, lassen auf neue Einblicke in solchen Modellen hoffen.

Phage display is a technique by which peptides are displayed on the surface of phage. The development of a novel phage display strategy, cosmix-plexing, allows the isolation of high affinity ligands. Cosmix-plexing allows recombination within hypervariable DNA regions, due to type IIs enzyme which bind at a defined sequence, but cleave a fixed distance away. This technique allows the reassortment of the right and left sections of hypervariable domains, and therefore increases the initial diversity of the library, or optimizes the binding capacities of a preselected population. A dedicated biased cosmix-plexing library for SH3 domains was designed, which contained three Pro at fixed positions, since SH3 domains show high preference for Pro-rich ligands. EVH1 domains also bind Pro-rich ligands and were also considered as a target for the library. High affinity ligands were isolated. BIAcore analyses were performed, which demonstrated that the KD of these ligands are in the nM range, i.e. their affinity for SH3 domains are 1000 fold higher than previously described SH3 binders. Such high affinity ligands allow the development of tools to investigate the function of SH3 domain in the signal transduction cascade, where SH3 natural ligands might be competed away in vivo, to tightly control and regulate the signal transduction. Preliminary experiments to deliver our SH3 peptides into living cells, using the Tat-fusion protein transduction system, allow optimism regarding these models.

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Horn, Nathalie: Isolation of high affinity ligands against SH3 and EVH1 domains using the phage display cosmix-plexing technology. 2000.

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