Charakterisierung der funktionellen Domänen von mDia1, einem Verbindungsprotein an der Schnittstelle zwischen der kleinen GTPase Rho und dem Aktin-Cytoskelett

Krebs, Anja

In der vorliegenden Doktorarbeit sollten die funktionellen Domänen von mDia1 charakterisiert werden. Ziel war es, die Bindungsstelle des Profilins in Zellen zu kartieren, sowie die Funktion der Rho-Bindungsstelle näher zu untersuchen, da diese nach Expression in Zellen extensives Ruffling verursacht. Durch die Benutzung verschiedener Deletionsfragmente, in vitro Experimente und transient transfizierter HeLa-Zellen, konnte gezeigt werden, daß die Interaktion mit Profilin über die prolinreiche FH1-Domäne vermittelt wird. Diese Ergebnisse konnten in vivo bestätigt werden. Stabil exprimierende CHO-Transfektanten, welche die Rho-Bindungsdomäne von mDia1 überexprimieren, weisen massive Membranaktivitäten, im Vergleich zu Zellen, welche das wt-Protein bzw. die Kontrolle EGFP exprimieren, auf. Zusätzlich zeigen die (1mDia exprimierenden Zellen eine schnellere Zellausbreitung, jedoch eine verlangsamte, gerichtete Lokomotion. Der Effekt des Rufflings benötigt desweiteren die homologe (1mDia-Sequenz, in humanen Zell-Linien tritt dieser Effekt nicht auf. Durch Verwendung dominant negativen Rac's konnte das Ruffling unterdrückt werden. Vermutlich kommt es zu einer Aktivierung des endogenen mDia1-Proteins nach Expression von (1mDia, indem dieses die intramolekulare Bindung des wt-Proteins aufbricht. Durch die Aktivierung des endogenen mDia1 kommt es zur vermehrten Bindung zellulären Rho-GTP's an dessen Rho-Interaktionsstelle. Als Konsequenz wird ein Anstieg Rac-vermittelter Effekte beobachtet, da es durch die vermehrte Wechselwirkung von endogenem mDia1 und GTP-Rho zu einer Verschiebung des Gleichgewichtes zwischen den kleinen GTPasen kommt

In this work the functional domains of mDia1 were studied. The aim was the identification of the binding site between mDia1 and profilin in cells. Furthermore, the function of the Rho-binding site of mDia1 was characterized, because after the expression of this fragment, cells showed extensive ruffling activity. The use of different deletion fragments, in vitro assays and transient transfected HeLa-cells showed, that the proline-rich FH1-domain is necessary and sufficient for the interaction of mDia1 and profilin in vitro and in cells. Stable transfected CHO-cells, expressing the Rho-binding domain of mDia1 showed extensive ruffling activity, enhanced cell spreading and a reduced locomotory activity in comparison to cells expressing the wt-protein mDia1 or the control EGFP. The ruffling effect depends on the homologous (1mDia-sequence, there is no effect in human cells. Furthermore, the membrane dynamics can be inhibeted through dominant negative Rac. Probably, the expression of (1mDia opens the intramolecular interaction of endogenous mDia1, thereby activating this protein. An increased binding of Rho-GTP to mDia1 could then shift the equlibrium between the small GTPases Rho, Rac and Cdc42. As a consequence of the increased binding of Rho-GTP to endogenous, activated mDia1 Rac-induced effects were intensified.

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Krebs, Anja: Charakterisierung der funktionellen Domänen von mDia1, einem Verbindungsprotein an der Schnittstelle zwischen der kleinen GTPase Rho und dem Aktin-Cytoskelett. 2000.

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