Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid-Analytik in der Bioprozeßüberwachung

Richter, Tanja

In der vorliegenden Arbeit wurden alternative Methoden zur bisher in der Bioprozeß-überwachung eingesetzten HPLC-Nukleotidanalytik entwickelt, so daß mit Hilfe von enzymatischen und elektrophoretischen Prinzipien eine on-line Überwachung über die Bestimmung relevanter Einzelparameter unter einer deutlichen Verkürzung der Analysendauer möglich wurde. Die Untersuchungen wurden anhand von zwei Analyten durchgeführt: zum einen wurde Xanthin ausgewählt, das eine direkte Kopplung mit dem Zellwachstum aufwies und zudem extrazellulär im Medium vorlag, und zum anderen Adenosintriphosphat (ATP) als intrazelluläre Komponente, das zwar nur indirekt über den Adenylate Energy Charge Wechselwirkungen mit dem Wachstumsverhalten zeigte, aber eines der wichtigsten Nukleotide darstellt. Die Basis zur Entwicklung geeigneter Detektionssysteme bildeten zunächst amperometrische Biosensoren. Zum Nachweis von ATP wurde das Enzympaar Hexokinase/Glucose-Oxidase gewählt, das auf verschiedene Trägermaterialien co- oder separat immobilisiert wurde. Zur Bestimmung von Xanthin wurde die Reaktion der Xanthin-Oxidase ausgenutzt, die über Polymereinschluß-Verfahren direkt auf die Arbeitselektrode einer Dickschichtelektrode oder über Quervernetzung auf Glas-Beads gebunden wurde. Die resultierenden Biosensoren wurden anschließend hin-sichtlich ihrer Stabilität und Sensitivität in einem Fließsystem charakterisiert. Neben dem enzymatischen Assay wurde Xanthin auch über elektrophoretische Verfahren nachgewiesen, wobei hierfür sowohl ein kommerzielles Kapillarelektrophorese-Instrument als auch integrierte mikrofluide Strukturen (Lab-on-a-Chip) zum Einsatz kamen. Mit Hilfe der miniaturisierten Systeme konnte im Vergleich zum Makrosystem das erforderliche Probenvolumen und der Reagenzienverbrauch reduziert und die Analyendauer deutlich verkürzt werden.

This work was focused on the development of alternative methods for HPLC-analysis of nucleotides in bioprocess monitoring to enable an on-line control by detecting relevant parameters and applying enzymatic and elektrophoretic principles leading also to decreasing analysis times. Two analytes were chosen for the following investigations: xanthine as an extracellular component showing a direct linkage to cell growth and adenosine triphosphate (ATP) as an intracellular substance which had only an indirect influence via the adenylate energy charge but belongs to one of the most important nucleotides. At first suitable detection systems were developed on the basis of amperometric biosensors. For ATP determination the enzyme couple hexokinase/glucose oxidase co- or separately immobilized on different supports was used. Xanthine detection based on the xanthine oxidase reaction. The enzyme was bound by a polymer inclusion procedure directly onto the working electrode of a thick film electrode or crosslinked via glutaraldehyde onto glass beads. The resulting biosensors were integrated into a flow injection system and characterized in regard to their stability and sensitivity. In addition xanthine was detected by applying electrophoretic separation techniques. A commercial capillary electrophoresis (CE) instrument and integrated microfluidic devices often described as lab-on-a-chip were used. In comparison with the macro-CE the sample requirement and reagent consumption could be reduced and shorter anaylsis times were obtained when xanthine separation was performed within a microsystem.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Richter, Tanja: Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid-Analytik in der Bioprozeßüberwachung. 2000.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export