Verbesserung des Energiestoffwechsels von kontinuierlichen Zellinien durch die Einführung einer Hefe-Pyruvat-Carboxylase

Irani, Noushin

Kontinuierliche Zellinien stellen wichtige Wirtszellen für die Produktion von Biopharmazeutika dar. Diese Zellen weisen jedoch stoffwechselspezifische Defekte auf, die man ebenfalls bei einer Reihe von entarteten Tumorzellen vorfindet. Dabei zeigen die Zellen einen überhöhten Substratverbrauchsbedarf mit geringer Energieausbeute und setzen im Gegenzug dazu große Mengen an toxischen bzw. die Produktion einschränkenden Nebenprodukten wie Lactat und Ammonium frei. Aufgrund einer sehr schwachen enzymatischen Verbindung zwischen der Glycolyse und dem Citratcyclus wird ein Großteil der verzehrten Glucose bei marginalem Energiegewinn unter aeroben Bedingungen über die Glycolyse metabolisiert. Durch die Einführung einer Hefe Pyruvat-Carboxylase in einer kontinuierlichen BHK-21 Zellinie und deren Expression im Cytosol der Zellen wird diese enzymatische Verbindung verstärkt und die Energieausbeute verbessert. Es zeigte sich, daß die Glucoseverbrauchsrate bis zu 4 fach und die Glutaminverbrauchsrate bis zu 2 fach reduziert wurde. Weiterhin konnte der zelluläre ATP Gehalt auf das 1,4 fache erhöht werden. Die Fluxrate von [14C]-Glucose und [14C]-Pyruvat in den Citratcyclus wurde erhöht, was auf eine erhöhte oxidative Phosphorylierungsrate hinweist. Zur Untersuchung der Produktionseigenschaften der genetisch veränderten Zellen wurden sowohl die PYC exprimierenden Zellen als auch die Kontrolle mit humanem Erythropoetin (rhuEPO) als Modellprotein transfiziert. Die PYC exprimierenden Zellen hatten im Vergleich zur Kontrolle die 2 fache substratspezifische Produktionsrate und erreichten in Perfusionskulturen etwa die doppelte rhuEPO Konzentration. Weiterhin zeigte sich, daß auch unter glucoselimitierten Bedingungen (0,05 - 1 g l-1) maximale Produktionsraten erreicht werden konnten, was zu einer verminderten Lactatanhäufung innerhalb einer fed-batch Kultivierung führen kann. Der verringerte Glucosebedarf der PYC exprimierenden Zellen bedingte darüber hinaus in einer Glutamin limitier

Continuous mammalian cell lines are important hosts for the production of biological pharmaceuticals. However, these cell lines show some severe disorders in primary metabolism which they have in common with many cancer cells. This leads to a high throughput of substrates giving a low energy yield and ample toxic side products such as lactate and ammonia. Since an enzymatic connection between glycolysis and the tricarboxylic acid cycle (TCA) is very poor, glucose is mainly degraded via oxidative glycolysis. It will be shown that introducing a pyruvate carboxylase gene into a continuous BHK-21 cell line and expressing it in the cytoplasma hereby reconstituting the missing link between the glycolysis and the TCA can reduce this problem. Thus glucose consumption could be reduced up to 4-fold and glutamine utilization up to 2-fold compared to the control and intracellular ATP content was enhanced 1.4 fold. The flux of labeled [14C]glucose into the TCA is shown to be enhanced indicating a higher rate of oxidative glucose degradation. To investigate the production characteristics of the genetically modified cells human erythropoietin (rhuEPO) was expressed in PYC and control cells as a model protein. PYC expressing cells showed a 2 fold higher substrate specific productivity and were able to achieve 2 fold rhuEPO concentrations in continuously perfused bioreactor cultures. Furthermore maximum production rates could be attained in PYC expressing cultures even under glucose-limiting conditions (0.05 to 1 g l-1) implying a reduced lactate accumulation in fed-batch cultures. As another result of a reduced glucose consumption rate the period of high cell viability was extended for 2 days (33) in a glutamine limited fed-batch culture in comparison to the control leading to a prolonged production phase with a 40 higher total product yield. Overall a better exploitation of C-sources, an increased product yield and a higher product integrity combined with lower production costs

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Irani, Noushin: Verbesserung des Energiestoffwechsels von kontinuierlichen Zellinien durch die Einführung einer Hefe-Pyruvat-Carboxylase. 2000.

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