Transformation of Nicotiana benthamiana with different BWYV (Beet western yellows virus)sequences to test for virus resistance

Valenzuela, Sofía

N. benthamiana plants were transformed by means of A. tumefaciens with either the viral replicase (ORF1/2), one of two smaller sequences involving the 5' and 3' ends (5'3'S and 5'3'AS) of the genome of BWYV or with the pBin19 vector alone (Kp). In total ca. 120 kanamycin (Km) resistant plantlets were generated. Of these 115 were positive by NPTII ELISA and/or PCR for the transgene (50, 24, 25 and 16 plants containing the ORF1/2, 5'3'S, 5'3'AS and Kp, respectively). Plants were transferred to the greenhouse and allowed to self-pollinate. Seeds from the primary transformants (To) were collected and tested for segregation on different Km concentrations (100 to 300 mg/l). Seeds from ca. 30 of the lines tested did not germinate or had a poor growth at these antibiotic concentrations. According to different criteria such as levels of NPTII ELISA of To lines, PCR, growth at 200 mg/l of Km and phenotype some lines were choosen as candidates to be tested for resistance against BWYV. 5 lines of each construct were randomly selected. These lines were analysed by Northern blot for expression of the transgene and/or the nptII gene. Different levels of expression of the transgene were found. Greenhouse resistance tests were performed twice (from June to August 1999 and August to October 1999). 15 transgenic N. benthamiana lines (5 per construct) as well as two controls (vector transformed and untransformed plants) were tested. Km resistant plantlets were transferred to the greenhouse and 20 plants from each line were inoculated with BWYV by means of green peach aphids (Myzus persicae), while other 20 were kept as uninoculated control. At 4, 6 and 8 weeks post infection (wpi) an BWYV ELISA of the inoculated plants was carried out and the height of each plant was measured, while the weight was determined at the end of the experiment (8 wpi). All 5'3'AS lines tested were susceptible to BWYV. Although plants from line SV 77 had low ELISA values at all times tested their final w

N. bethamiana Pflanzen wurden mittels Agrobakterien mit der viralen Replikase (ORF1/2), einer fusionierte Sequenz, die das 5' und 3' Ende (5'3'S und 5'3'AS) des BWYV enthält, oder nur mit dem pBin19 Vektor (Kp) transformiert. Insgesamt wurden 120 kanamycin (Km)-resistente Pflanzen regeneriert. Davon waren 115 positiv im NPTII ELISA und/oder in der PCR (50, 24, 25 und 16 Pflanzen enthielten ORF1/2, 5'3'S, 5'3'AS bzw. Kp). Die Pflanzen wurden in das Gewächshaus überführt und geselbstet. Die Samen der Primärtransformanten (To) wurden durch zum Testen der Aufspaltung auf unterschiedlichen Km-Konzentrationen (100-300 mg/l) gehalten. Samen von ca. 30 der getesteten Linien keimten nicht oder zeigten bei dieser Antibiotika-Konzentration ein spärliches Wachstum. Infolge unterschiedlicher Kriterien wie NPTII ELISA der To Linien, PCR, Wachstum auf 200 mg/l Km und Phänotyp wurden je 5 Linien pro Konstrukt als Kandidaten für den Resistenztest gegen BWYV ausgewählt. Diese Linien wurden im Northern blot auf die Expression der viralen Gensequenzen analysiert. Unterschiedliche Expressionsniveaus dieser Gene wurden gefunden. Gewächshaus-Resistenztests wurden zweimal (von Juni bis August 1999 und August bis Oktober 1999) durchgeführt. 15 transgene Linien (5 je Konstrukt) und jeweils 2 Kontrollen (mit dem Vektor-transformierten und nicht transformierte Pflanzen) wurden getestet. Km-resistente Pflanzen wurden in das Gewächshaus überführt und 20 Pflanzen jeder Linie mittels Grüner Pfirsichblattlaus (M. persicae) mit BWYV inokuliert, während andere 20 nicht inokulierte Pflanzen als Kontrolle dienten. Jeweils 4, 6 und 8 Wochen nach Infektion erfolgten ein BWYV ELISA-Test der inokulierten Pflanzen, das Vermessen der Wuchshöhe und am Ende des Experiments (8 Wochen nach Infektion) das Bestimmen des Gewichts. Alle getesteten 5'3'AS Linien waren anfällig gegen BWYV. Obwohl die Pflanzen der Linie SV 77 bei allen Tests einen niedrigen ELISA-Wert hatten, waren das Gewicht und die Höhe ähnlich



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