Herstellung der Thermus aquaticus DNA-Polymerase und Untersuchung ihrer dNTP-Substrataffinität

Czubayko, Martin

Es wurde untersucht, ob die Basen der ß-2'-Desoxynukleosidtriphophate (dNTPs) einen Einfluß auf die Polymerisationsreaktion und die dNTP-Substrataffinität der thermophilen Taq DNA- Polymerase aus Thermus aquaticus ausüben. Dazu wurden die vier Aminosäuren Val586, Phe667, Tyr671 und His784 in dem katalytischen Zentrum der Taq DNA-Polymerase durch größere Aminosäuren substituiert. Insgesamt wurden acht Varianten der Taq DNA-Polymerase hergestellt und gereinigt. Für die Untersuchung der Varianten der Taq DNA-Polymerase wurden die spezifische Aktivität, die DNA-Dissoziationskonstante KD(DNA) sowie die Michaelis-Menten Konstante KM und die maximale Katalysegeschwindigkeit kcat für dTTP und dATP bestimmt. Die Ergebnisse der kinetischen Konstanten KM(dNTP) zeigen, daß die dNTP-Substrataffinität bzw. - spezifität der Taq DNA-Polymerase von der Stärke der vertikalen Wechselwirkungen zwischen den Basen des dNTPs und der DNA, und somit von der DNA-Sequenz, beeinflußt wird. Durch diesen Effekt weist die Taq DNA-Polymerase mit homologer DNA zu dATP (Purin-dNTP) eine etwa 12mal höhere Affinität bzw. Spezifität auf als zu dTTP (Pyrimidin-dNTP). Durch die Einführung der größeren Aminosäuren wird die dNTP-Substrataffinität der Varianten der Taq DNA-Polymerase zu dATP stärker diskriminiert als zu dTTP. Die bei homologer DNA native dATP-Substratspezifität der Taq DNA-Polymerase wird bei den Varianten dadurch verringert bzw. nivelliert.

The influence of the bases of the ß-2'-deoxynucleosidetriphosphates (dNTPs) on the reaction of polymerisation and the dNTP substrate affinity of the thermophile Taq DNA polymerase from Thermus aquaticus was investigated. The four amino acids Val586, Phe667, Tyr671 and His784 in the catalytic centre of the Taq DNA polymerase were substituted by larger amino acids. Altogether, eight variants of the Taq DNA polymerase were prepared and purified. The specific activity, the DNA dissociation constant KD(DNA) as well as the Michelis-Menten constant KM and the turnover number kcat for dTTP and dATP were determined for the investigation of the variants of the Taq DNA polymerase. The results of the kinetic constants KM(dNTP) suggest, that the dNTP substrate affinity and the specificity of the Taq DNA polymerase, respectively, is influenced by the strength of the stacking interactions between the bases of the dNTP and the DNA and therefore by the sequence of the DNA. As a consequence of this, the Taq DNA polymerase exhibits approximately a 12fold higher affinity and specificity, respectively, for dATP (purine- dNTP) than for dTTP (pyrimidine-dNTP). The dNTP substrate affinity of the variants of the Taq DNA polymerase for dATP is stronger discriminated than for dTTP by the introduction of the larger amino acids. The native dATP substrate specificity of the Taq DNA polymerase with homologous DNA is therefore reduced or leveled by the variants.

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Czubayko, Martin: Herstellung der Thermus aquaticus DNA-Polymerase und Untersuchung ihrer dNTP-Substrataffinität. 2000.

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