Synthese und Eigenschaften neuer peptidischer Phosphatase-Inhibitoren auf Phosphonat-Basis

Wiemann, Arndt Christian

In der vorliegenden Arbeit werden die Synthesen neuer Phosphonat-Derivate des Phosphoserins sowie deren Einbau in Peptide beschrieben und die Eignung der Peptide als Phosphatase-Inhibitoren untersucht. Folgende Derivate wurden synthetisiert: N-Fmoc-geschützte 2-Amino-4-dialkylphosphato-dialkylphosphono-buttersäure (bezeichnet als Phosphat-Phosphonat), N-Fmoc- und O4-MEM-geschützte 2-Amino-4-dialkylphosphono-4-hydroxy-buttersäure (bezeichnet als Hydroxyphosphonat). Beide Derivate wurden mittels Festphasenpeptidchemie in die Peptidsequenz AAEGGXNVFSK (mit X = Derivat) eingebaut und die erhaltenen Peptide vollständig entschützt. Bei Untersuchungen zur Inhibition der alkalischen Phosphatase durch das Phosphat-Phosphonat-Peptid (das sowohl als Substrat als auch als Inhibitor fungiert) wurde bei Inhibitorkonzentrationen von 0,3/0,6/1,0 mM eine positive Kooperativität beobachtet, die die Verwendung dieses Derivates als nicht sinnvoll erscheinen läßt. Bei Verwendung des Hydroxyphosphonat-Peptids zur Inhibition wurde im gleichen Konzentrationsbereich eine kompetitive Inhibition beobachtet und die inhibitorische Konstante Ki zu ca. 0,4 mM bestimmt. Diese Art der Inhibition resultiert aus der Bindung des Hydroxyphosphonat-Peptids im aktiven Zentrum des Enzyms, die mit der Bindung des natürlichen Substrats (X = Phosphoserin) konkurriert. Anwendungsmöglichkeiten des neuen Derivates liegen zum einen in der Reinigung von Phosphatasen durch Affinitätschromatographie, zum anderen in der Untersuchung von phosphatase-katalysierten zellulären Mechanismen wie der Signaltransduktion.

In this thesis the synthesis of new phosphonate derivatives of phosphoserine and their incorporation into peptides are described and the suitability of the peptides as phosphatase inhibitors are examined. The following derivatives were synthesized: N-Fmoc-protected 2-Amino-4-dialkylphosphato-dialkylphosphono-butyric acid (termed phosphate-phosphonate), N-Fmoc- and O4-MEM-protected 2-Amino-4-dialkylphosphono-4-hydroxy-butyric acid (termed hydroxyphosphonate). Both derivatives were incorporated into the peptide sequence AAEGGXNVFSK (X = derivative) using solid phase peptide chemistry and the peptides were completely deprotected. In tests of inhibition of alkaline phosphatase by the phosphate phosphonate peptide (which serves as substrate as well as inhibitor) at inhibitor concentrations of 0.3/0.6/1.0 mM a positive cooperativity was observed, thereby suggesting the use of this derivative as inhibitor being not feasible. Using the hydroxyphosphonate peptide for inhibition in the same range of concentration a competitive inhibition was observed and the inhibitory constant Ki was determined to be about 0.4 mM. This way of inhibition results from binding of the hydroxyphosphonate peptide to the active site of the enzyme competing with binding of the natural substrate (X = phosphoserine). As applications of the new derivative the purification of phosphatases by affinity chromatography has to be mentioned as well as examinations of phosphatase catalyzed cellular mechanismns, especially in the field of signal transduction.

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Wiemann, Arndt: Synthese und Eigenschaften neuer peptidischer Phosphatase-Inhibitoren auf Phosphonat-Basis. 1999.

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