Nachweis von Nukleinsäure-Wechselwirkungen mit Hilfe optischer Biosensoren

Kuhlmeier, Dirk

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob sich optische Biosensoren eignen, um Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren nachweisen zu können. Dabei wurden der Gitterkoppler, ein integriert-optischer Detektor, sowie das BIAcore-System verwendet. Beide Detektoren nutzen ein sensitives, sog. evaneszentes Feld, um Anlagerungen von Molekülen auf der Sensoroberfläche zu verfolgen. Dieses elektromagnetische Feld wird bei beiden Geräten durch optische Anregung induziert. Wichtig für die Anwendung von Biosensoren ist eine möglichst hohe Dichte von 'Erkennungsmolekülen' auf der Sensoroberfläche. Deshalb wurden die Belegung zu Beginn mit Hilfe eines Atom-Kraftmikroskops (AFM) untersucht. Damit konnte die Dichte des immobilisierten Proteins Avidin charakterisiert sowie das Anlagerungsverhalten von DNA an verschieden modifizierten Oberflächen untersucht werden. Um Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuremolekülen mit Hilfe der optischen Biosensoren zu detektieren, wurde ein Reaktionspartner, ein kurzes Oligonukleotid ('Sonde'), chemisch oder vermittelt durch das Affinitätspaar Avidin-Biotin auf die Oberfläche immobilisiert. War aufgrund übereinstimmender Basenabfolge eine Doppelstrang-bildung ('Hybridisierung') zwischen der kurzen Sonde auf dem Sensor und einer Probe möglich, veränderte sich durch die Anlagerung der effektive Brechungsindex auf der Oberfläche. Diese Verschiebung konnte durch die optischen Biosensoren gemessen werden. Beide Sensoren wurden in Hinblick auf Konzentrations- und Längenabhängigkeit der Oligonukleotidprobe charakterisiert. Dabei zeigte sich eine niedrigere Nachweisgrenze beim BIAcore, die auf die unterschiedlichen Oberflächen der Sensoren zurückzuführen war. Anhand von zwei Applikationen wurde untersucht, ob die Biosensoren konventionelle Methoden der Molekularbiologie ergänzen bzw. ersetzen können. In der ersten Anwendung wurde versucht, ein bakterielles Plasmid anhand einer spezifischen Basenabfolge nachzuweisen. Es zeigte

This work is focused on the use of optical biosensors and their possible application to nucleic acid analysis. Therefore, the integrated optical grating coupler system and the BIAcore, a system based on surface plasmon resonance (SPR) were used. Both devices exploit a propagating electromagnetic field, which is induced by optical irradiation. Direct sensing of (bio-)chemical reactions is based on the change of the effective refractive index of a waveguide mode due to the adsorption of molecules to the surface of the sensor. Desirable for the application of biosensors is a high density of surface bound receptor molecules. To characterize the homogeneity of the surface coverage and orientation of the biomolecules, the atomic force microscope (AFM) was utilized. The investigations focused on the binding of the protein avidin and the adsorption of DNA to different modified surfaces. To investigate the hybridization of nucleic acid strands, a short oligonucleotide was bound to the sensor surface via covalent binding or via the affinity couple biotin-avidin. Hybridization was observable in real time depending on the sequence of the probe strand. Both optical biosensors mentioned above were characterized in terms of signal dependency of the concentration and length of the probe oligonucleotide. However, with respect to the different loading capacities of the sensor surfaces, the BIAcore system showed a lower detection limit compared to grating coupler experiments. Two different applications were chosen to investigate whether optical biosensors could complement or replace conventional methods in molecular biology: The first application demonstrated the specific detection of a bacterial plasmid. It was shown that the denatured plasmid resulted in no detectable signal. However, an amplified plasmid sequence produced by asymmetric polymerase chain reaction (PCR) could be hybridized easily to the sensor surface. The dependency between biosensor signal and

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Kuhlmeier, Dirk: Nachweis von Nukleinsäure-Wechselwirkungen mit Hilfe optischer Biosensoren. 2000.

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