Prä-mRNA Splicing in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe : In vivo Charakterisierung der Funktion des srp2 Gens

Lützelberger, Martin

In dieser Arbeit wird die Isolierung des srp2 Gens der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe beschrieben. Das srp2 Gen besteht aus 10 Exons und 9 Introns. Es ist fuer das mitotische Wachstum essentiell. Es kodiert fuer ein Protein von 365 Aminosaeuren, das zur Familie der SR-Proteine gehoert. Srp2 besteht aus zwei N-terminalen RNA-Bindungsdomaenen (RBD) und einer C-terminalen argininreichen Domaene (RRD). Die RBDs enthalten die fuer diese Proteine typischen Sequenzmotive RNP-1 und RNP-2, sowie zwei Signatursequenzen EFEDxRDA und SWQDLKD. Die RRD von Srp2 enthaelt zwei kurze SR-Dipeptid Elemente, sowie ein Sequenzmotiv (DEYRR), das sich elfmal wiederholt. Die Funktion von Srp2 wurde durch eine gerichtete Mutagenese und die Ueberexpression in einem S.pombe Stamm untersucht. Diese Untersuchungen zeigen, dass die zweite RBD fuer die spezifische Funktion von Srp2 verantwortlich ist. Srp2 ist ein Kernprotein. Durch die Fusion mit dem Green Fluorescent Protein (GFP) konnte gezeigt werden, dass die beiden SR-Dipeptid Elemente der argininreichen Domaene als Kerntransportsignal wirken. Die Funktion der verschiedenen Domaenen von Srp2 wurde durch die Ueberexpression in S.pombe, sowie eine gerichtete Mutagenese untersucht. Die Funktion der mutierten cDNAs wurde durch die Komplementierung eines konditional letalen Stamms untersucht, in dem die Expression des srp2 Gens mit Hilfe des nmt1-8 Promotors reprimiert werden kann. Die Charakterisierung dieses Stamms ergab, dass Srp2 vermutlich fuer das Spleissen einer spezifischen prae-mRNA benoetigt wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass Srp2 am Spleissen von prae-mRNA beteiligt ist.

This work describes the identification and isolation of the srp2 gene of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. srp2 is composed of 10 Exons and 9 Introns and is essential for growth. srp2 encodes a protein of 365 amino acids which is similar to SR protein splicing factors of mammals. Srp2 consists of two RNA binding domains (RBDs) at the N-terminus which are followed by an arginine-rich C-terminal domain, containing two RS dipeptide Elements and an eleven times repeated sequence motif DEYRR. The RBDs contain the signatures EFEDxRDA and SWQDLKD, respectively. These sequences were found in the RBDs of all metazoan SR proteins containing two RBDs. The function of the srp2 gene was characterised in vivo, taking the advantage of S.pombe genetics. Overexpression studies of different domains of Srp2 suggest that the second RBD is responsible for the specific function of the protein. A conditional lethal strain was constructed, containing the srp2 gene under the control of the thiamine-repressible nmt1-8 promotor, which can be swiched of conditionally by the addition of thiamine. The ability of several mutated srp2 cDNAs was tested to complement this strain. Characterization of the strain revealed that srp2 may be involved in splicing of a specific pre-mRNA. Replacement of RBD1 of srp2 with RBD of srp1, the first SR protein isolated from fission yeast, revealed, that it can substitute for the function of RBD1 of srp2. Localization studies with fusions of distinct domains of Srp2 to GFP (Green Fluorescent Protein) show, that the arginine-rich domain is necessary and sufficient to target this protein into the nucleus. Mutagenesis of srp2 revealed that both SR dipeptide elements are involved in targeting of srp2 into the nucleus. The results of this work suggest that srp2 may be involved in pre-mRNA splicing.

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Lützelberger, Martin: Prä-mRNA Splicing in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe : In vivo Charakterisierung der Funktion des srp2 Gens. 2000.

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