Physiologischer Zustand von rekombinanten Escherichia coli in Hochzelldichtekultivierungen bei der Produktion

Hoffmann, Frank

Glukose-limitierte Hochzelldichtekultivierungen des rekombinanten Bakteriums Escherichia coli TG1 p[lambda]FGFB wurden zur Produktion des humanen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) benutzt. Die bFGF-Bildung wurde durch einen Temperatursprung induziert. Die Ausbeuten an löslichem, aktivem bFGF wurde durch Aggregation und durch Bildung von Einschlußkörpern (inclusion bodies) begrenzt. Die spezifische Konzentration an bFGF erhöhte sich ab vier Stunden nach Induktion nicht mehr. Die Glukose-Zufütterungsrate während der Induktionsphase hatte keinen Einfluß auf die Endkonzentration von bFGF. Modell-Simulationen und Pulse-Chase-Experimente legen eine interne Limitierung durch den physiologischen Zustand der Bakterien nahe. Protein-Bildungsgeschwindigkeiten wurden mit radioaktiver Markierung und Auftrennung durch zweidimensionale Gelelektrophorese gemessen. Der physiologische Zustand der Zellen ist durch die Bildung von Proteinen, die nicht zum Zellwachstum beitragen, bestimmt. Die bFGF-Bildungsgeschwindigkeit überstieg die Akkumulationsgeschwindigkeit deutlich. Hitzeschockproteine, die der Zellerhaltung unter Streßbedingungen dienen, wurden dauerhaft gebildet. Zusammen machten bFGF und Hitzeschockproteine 80 der Gesamtproteinsynthese aus. Obwohl die Gesamtproteinsynthese nach dem Temperatursprung deutlich gesteigert wurde, blieben kaum Ressourcen zur Bildung von „Haushaltsproteinen“ übrig. Entsprechend sank die Wachstumsrate nach der Induktion um 60 ab. In Kontrollkultivierungen mit E. coli TG1 pCytexP1, das den „leeren“ parentalen Expressionsvektor trug, ließen sich zwei Phasen unterscheiden: unmittelbar nach dem Temperatursprung wurden Hitzeschockproteine, später mit steigendem Plasmidmassenanteil konstitutiv synthetisierte Plasmid-kodierte Proteine gebildet. Da Proteinsynthese viel Energie verbraucht, wurde der Katabolismus intensiviert. Dazu wurden metabolische Enzyme induziert. Aus der gestiegenen Kohlendioxidbildungsrate und der o

Glucose-limited high-cell density-cultivation of recombinant Escherichia coli TG1 p[lambda]FGFB were employed to produce human basic fibroblast growth factor (bFGF). Synthesis of bFGF was induced by a temperature shift. The yield of soluble, active bFGF was restricted by aggregation and formation of inclusion bodies. Four hours after induction the specific bFGF concentration did not increase further. The feeding rate of glucose during the induction phase did not influence the final bFGF concentration. Model simulation and pulse chase experiments indicate an internal limitation by the physiological state of the bacteria. Synthesis rates of proteins were measured by radioactive labelling and subsequent separation by two-dimensional gel electrophoresis. The physiological state of the cells is characterised by the synthesis of proteins which does not contribute to biomass formation. The synthesis rate of bFGF surmounted the accumulation rate by far. Heat-shock proteins, which serve cell maintenance under stress conditions, were produced permanently. Together bFGF and heat-shock proteins accounted for 80 of the total protein synthesis. Although the total protein synthesis increased considerably after the temperature shift, only minor resources were left for housekeeping proteins. The specific growth rate declined accordingly by 60 In control cultivation of E. coli TG1 pCytexP1, carrying the “empty” parental expression vector, two phases could be distinguished: immediately after the temperature shift mainly heat-shock proteins were produced. When the plasmid content rose later on, the synthesis of constitutive plasmid-coded proteins increased. As protein synthesis demands much energy, the catabolism was intensified. This required induction of metabolic enzymes. From the increasing carbon dioxide evolution rate and the online available specific growth rate, the fraction of proteins that does not contribute to biomass formation, relative to the total

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Hoffmann, Frank: Physiologischer Zustand von rekombinanten Escherichia coli in Hochzelldichtekultivierungen bei der Produktion. 1999.

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