Die Spaltung cyanogener Diglucoside : Reinigung und Charakterisierung von Diglucosidasen aus Hevea brasiliensis

Hillmar, Susanne

In cyanogenen Pflanzen können cyanogene Monoglucoside als Diglucoside transportiert werden. Im sink-Gewebe werden die diglucosidischen Transportmetaboliten enzymatisch von Diglucosidasen hydrolysiert. In dieser Arbeit wurden die Diglucosidasen, die an dieser Spaltung beteiligt sind, untersucht. Diese Hydrolyse kann entweder sequentiell oder im Zuge eines simultanen Abbaus erfolgen. Im ersten Fall wird durch die sequentielle Diglucosidase lediglich die terminale Glucose der cyanogenen Diglucoside abgespalten, im zweiten Fall findet eine vollständige Hydrolyse durch die simultane Diglucosidase unter Freisetzung von Gentiobiose statt. Die sequentielle Diglucosidase konnte aus Hevea brasiliensis bis zur Homogenität gereinigt werden. Die Aufreinigung einer simultanen Diglucosidase wurde aus den Wedeln des Farns Davallia bullata durchgeführt. Hevea brasiliensis - Die sequentielle Diglucosidase besitzt eine hohe Affinität zur pflanzlichen Zellwand. Der Einsatz von Hochsalz-Bedingungen führt zu einer Ablösung des Enzyms von den Zellwandtrümmern. - Die Aktivität der sequentiellen Diglucosidase in Blättern ist stark vom Blattstadium abhängig. - Die sequentielle Diglucosidase aus Blättern wurde über selektive Extraktion, Ammoniumsulfatfällung, Gelfiltration, Kationenaustauscherchromatographie und präparative native kationische Gelelektrophorese bis zur Homogenität gereinigt. Zur enzymologischen Charakterisierung der Diglucosidase wurde die pH-Abhängigkeit, die optimale Inkubationstemperatur und das Substratspektrum ermittelt. Die Km- und Vmax-Werte für die cyanogenen Diglucoside Amygdalin, Linustatin und Neolinustatin sowie für das artifizielle Substrat p-Nitrophenyl-ß-Glucosid wurden bestimmt. - Die sequentielle Diglucosidase wird durch die typischen ß-Glucosidase-Hemmstoffe stark inhibiert. - Das Molekulargewicht der nativen Form beträgt 365 kD, die Größe der Untereinheiten 67, 59 und 57 kD. Die sequentielle Diglucosidase ist ein Glycoprotein.

Translocation of cyanogenic (mono-) glycosides is performed in the vascular system of the plant via the corresponding diglucosides. In the sink-tissue, the diglucosidic transport metabolites are hydrolyzed enzymatically by diglucosidases. Two different mechanisms are known: in the course of sequential cleavage, only the terminal glucose moiety is split off. In contrast, in the case of simultaneous cleavage, the glucose moieties are split off at the same time as gentiobiose. These different diglucosidases from the cyanogenic plants Hevea brasiliensis and Davallia bullata were purified to electrophoretic homogeneity and characterized. Hevea brasiliensis - The enzyme which hydrolyzes cyanogenic glucosides by a sequential cleavage is called sequential diglucosidase. - The sequential diglucosidase reveals high affinity to cell wall constituents. Under high salt-conditions the enzyme is released from the cell wall. - The activity of the enzyme depends on the physiological state of the plant material. - The sequential diglucosidase was purified using selective extraction, ammonium sulfate precipitation, gelfiltration, cationic ion-exchange chromatography, and preparative native cationic polyacrylamide gel electrophoresis. The purified enzyme was characterized by the determination of the pH-optimum, the substrate specificity, and the maximum hydrolytic temperature. The kinetic properties (Km, Vmax) for different cyanogenic glucosides and artificial substrates were measured. - The enzyme was significantly inhibited by castanospermine, N-D-glucosylpiperidine, and nojirymycine. - The native molecular weight of the enzyme was 365 kD. SDS-PAGE analysis yielded three polypetides with molecular weights of 67, 59 and 57 kD. The sequential diglucosidase is a glycoprotein. Davallia bullata - A simultaneous diglucosidase could be isolated from the fronds of the fern Davallia bullata. The enzyme was purified to homogeneity by a Nickel Chelate Affinity

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Hillmar, Susanne: Die Spaltung cyanogener Diglucoside : Reinigung und Charakterisierung von Diglucosidasen aus Hevea brasiliensis. 1999.

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