Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zum 3,6-Dichlor-2-methoxybenzoat-Abbau durch Sphingomonas sp. RW5

Werwath, Jörn

Der Stamm RW5 wurde mit 3,6-Dichlor-2-methoxybenzoat (36DC2MBA) als alleiniger Kohlenstoff- und Energiequelle aus aeroben Sedimenten des Flusses Elbe isoliert und durch Analyse der 16S rDNA als Sphingomonas sp. identifiziert. Der Stamm RW5 konnte 36DC2MBA und 3,6-Dichlorsalicylat vollständig mineralisieren und bildete während der exponentiellen Wachstumsphase mit beiden Verbindungen jeweils einen Metaboliten, der als 3,6-Dichlorgentisat identifiziert werden konnte. Außerdem konnte der Stamm 3,6-Dichlorgentisat, nicht aber 3,6-Dichlorbrenzkatechin als Kohlenstoff- und Energiequelle verwerten. Sauerstoffaufnahmeraten 36DC2MBA-gewachsener Zellen zeigten dementsprechend signifikante Aktivitäten für 36DC2MBA, 3,6-Dichlorsalicylat und 3,6-Dichlorgentisat, dagegen nur sehr geringe Aktivitäten für 3,6-Dichlorbrenzkatechin und keine für Brenzkatechin. In zellfreien Extrakten des Stammes war eine hohe spezifische Aktivität für eine Gentisinsäure-1,2-Dioxygenase nachzuweisen, die auch 3,6-Dichlorgentisat umsetzen konnte, wogegen Aktivitäten für eine Salicylat-5-Hydroxylase und eine der Brenzkatechin-Dioxygenasen nicht nachweisbar waren. Maleylpyruvat wurde von zellfreien Extrakten des Stammes RW5 in einer Glutathion-abhängigen Reaktion vollständig umgesetzt. Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß der Stamm RW5 36DC2MBA über einen (Chlor)-Gentisat-Weg abbaut. Das Gen, das für eine Gentisinsäure-1,2-Dioxygenase (GDO) kodiert, sollte identifiziert und charakterisiert werden. Dazu wurde ein 4.103 bp großes, daß GDO-Gen enthaltende DNA-Fragment aus einer Plasmidbank von Sphingomonas sp. RW5 kloniert und sequenziert. Das Gen gtdA kodiert für ein 350 Aminosäuren großes Protein mit einer berechneten Größe von 38,85 kDa. Sequenzvergleiche der vorhergesagten Aminosäuresequenz von gtdA zeigten keine signifikanten Homologien (jeweils <13) zu bisher bekannten Proteinsequenzen ringspaltenender Dioxygenasen des intradiolen- und extradiolen Typs.

The bacterial strain RW5 was isolated from aerob sediments of the Elbe river by using 3,6-dichloro-2-methoxybenzoate (36DC2MBA) as sole source of carbon and energy. The strain was identified by 16S rDNA analysis as a Sphingomonas sp. Strain RW 5 mineralised 36DC2MBA and 3,6-dichlorosalicylate by producing 3,6-dichlorogentisate as a growth-metabolite during growth with these compounds. The strain used 3,6-dichlorogentisate as sole source of carbon and energy but not 3,6-dichlorocatechol. Oxygen uptake rates with 36DC2MBA-grown cells showed significant activities for 36DC2MBA, 3,6-dichlorosalicylate and 3,6-dichlorogentisate but no activity for 3,6-dichlorocatechol and catechol. Cell free extracts showed a high specific activity for a gentisate 1,2-dioxygenase which could also catalyse 3,6-dichlorogentisate. Enzyme acitivities of an active salicylate 5-hydroxylase or a catechol-dioxygenase were not present in cell free extracts. Maleylpyruvate was transformed with cell free extracts in a glutathion-dependend reaction completely. Therefor 36DC2MBA is degraded in strain RW5 by a (chloro-)gentisate pathway. A 4.103 bp long DNA fragment containing the structural gene of a gentisate 1,2-dioxygenase (E.C.1.13.11.4), gtdA, from Sphingomonas sp. strain RW5 was cloned and sequenced. The gtdA gene encodes a 350 amino acid polypeptide with a predicted size of 38.85 kDa. Comparison of the gtdA gene product with protein sequences in databases, including those of intradiol or extradiol ring-cleaving dioxygenases, revealed no significant. This gentisate 1,2-dioxygenase is thus a member of a new class of ring-cleaving dioxygenases. The gene was subcloned and hyperexpressed in E. coli. The resulting product was purified to homogeneity and partially characterised. Under denaturing conditions the polypeptide exhibited an approximate size of 38.5 kDa and migrated on gel filtration as a species with a molecular mass of 177 kDa.

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Werwath, Jörn: Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zum 3,6-Dichlor-2-methoxybenzoat-Abbau durch Sphingomonas sp. RW5. 1998.

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