Robotergestützte Präparation von Bakterienklonen: Unüberwachte Plasmidisolierung und PCR-Sequenzierung.

Kauer, Gerhard

Moderne Sequenzierprojekte haben die Bestimmung der Basenabfolge kompletter Genome zum Ziel. Wegen der entspechend anfallenden Laborarbeiten ist die Bewältigung derartiger Vorhaben nur noch durch weitgehende Automation der notwendigen Präparationen möglich. In dieser Arbeit werden kommerziell erhältliche Roboter und apparative Eigenentwicklungen in der Weise kombiniert, daß eine unüberwachte Präparation von Plasmidvektoren aus lebenden Bakterien möglich wird. Die Automatisierung schließt eine PCR-Sequenzierung mit ein, so daß am Prozeßende auftragsfähige Lösungen für Sequencer des Typs ABI bzw. A.L.F. vorliegen. In einer nicht sensorisch rückgekoppelten Roboteranlage, wie sie in dieser Arbeit verwirklicht wurde, muß eine ausreichende Lagestabilisierung der Einzelkomponenten gewährleistet sein. Bewegte Teile müssen durch besondere Konstruktionen in definierte Positionen gebracht werden, um auftretende Toleranzen auszugleichen. Ein Ergebnis dieser Arbeit ist unter anderem ein mechanisches Korrektursystem, das erst den automatisierten Betrieb der Plasmidpräparation ermöglicht. Die Plasmid-Präparationsprotokolle der Fa. Qiagen wurden auf die entstandene Anlage portiert. Hierzu wurde eine Vakuumkammer entwickelt, die über eine eigens hierfür konzipierte elektronische Ansteuerung verfügt. Über diese Elektronik wird unter anderem die Vakuumkammer von einer Regelungs- und Steuerungssoftware angesteuert. Diese Software ist objektorientiert entworfen, gemäß Iso9000 dokumentiert und in C++ implementiert worden. Sie regelt nicht nur die Ventileinstellungen der Vakuumkammer sondern moderiert auch die Kommunikation der übrigen Roboter und die Ansteuerung der am Ablauf des Protokolls beteiligten Maschinen.

Modern sequencing efforts are targetting the analysis of complete genomes. The huge amount of work to be done in laboratory may only be fulfilled with automated processing of the corresponding preparations. In this thesis, commercially available robot systems and new developments were combined, so that an unattended preparation of plasmid vectors directly from living bacteria is possible. The automation process includes a PCR-sequencing reaction which produces samples which can directly be fed into sequencers like A.L.F. or some models of ABI. In a robot system which has no sensoric feed-back strategy, like developed in this thesis, should have a sufficient site-stabilization of each component which is to be moved. Special constructions which compensate occurring tolerances ensure, that moved parts will remain in perfect matched position. One result of this thesis is a mechanical correction system which finally makes unattended operation possible. Qiagen's protocols for plasmid preparation are used with this system. For this, a vacuum chamber was developed which uses an own electronic system. With this, the vacuum chamber is regulated by a monitoring software package. This software has an object oriented design, is documented using the ISO9000 scheme and implemented in C++. The software is not only regulating the valves of the vacuum chamber but moderates the communication of all other robots and other machines being involved in the preparation protocol, too.

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Kauer, Gerhard: Robotergestützte Präparation von Bakterienklonen: Unüberwachte Plasmidisolierung und PCR-Sequenzierung.. 1999.

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