Verfahrenstechnische und kinetische Aspekte der Renaturierung des humanen Wachstumsfaktors aus Blutplättchen (PDGF) aus Einschlußkörpern

Müller, Carsten

In der vorliegenden Dissertation erfolgte die Entwicklung einer Renaturierungsmethode für den humanen Wachstumsfaktor aus Blutplättchen (PDGF, platelet-derived growth factor) aus Einschlußkörpern rekombinanter E. coli. Hierzu wurde die Technik der Gelfiltration angewendet, wobei monomere Faltungsintermediate entstehen, die nach Elution zum biologisch aktiven disulfidverbrückten Dimer reagieren (Dimerisierung). Durch Variation verschiedener Umgebungsparameter wurden bis zu 76 Gesamtausbeute erhalten. Das Ausmaß der Aggregation lag auch bei Einsatz hoher Konzentrationen an denaturiertem Protein (5 mg ml-1) unter 10 (gegenüber 50 bei 10 µg ml-1 bei der klassischen Renaturierungsmethode durch Verdünnung). Die Reaktionsordnung der geschwindigkeitsbestimmenden Teilreaktion der Dimerisierung wurde zu eins bestimmt. Es wurde weiterhin beobachtet, daß die Dimerisierung zum heterodimeren PDGF-AB mit um den Faktor drei größeren Geschwindigkeitskonstanten verläuft als die Reaktion zu den homodimeren Isoformen PDGF-AA und PDGF-BB. Dieser Sachverhalt läßt sich mit allgemeinen Konformationsänderungen auf der Ebene der Dimere interpretieren. Der Monomerumsatz dieser Reaktion ist unvollständig und konnte durch Modellierung der kinetischen Daten auf unkorrekt gefaltete Intermediate, die unfähig zur spezifischen Assoziation der Monomere und/oder zur Ausbildung der Disulfidbrücken sind, zurückgeführt werden.

The object of this PhD-thesis was the development of a renaturation procedure for PDGF (platelet-derived growth factor) from inclusion bodies of recombinant E. coli. For this purpose a gelfiltration method was designed that yields monomeric folding intermediates. After elution from the column the monomeric species react to the biologically active disulfide bridged dimer (dimerization). By variation of different process parameters a total yield of 76 was obtained. The extent of aggregation was even at high concentrations of denatured protein (5 mg ml-1) very low and was determined to be under 10 (in contrast to 50 at 10 æg ml-1 with the classical renaturation method via dilution). The reaction order of the dimerization kinetics was found to be one. Further more it was observed, that the dimerization to the heterodimeric PDGF-AB yields rate constants which are three times higher than those for the reaction to the homodimeric PDGF-AA and PDGF-BB. These two findings indicate that general conformational changes on the dimer level are the rate limiting step for the dimerization. The monomer turnover was not complete. By kinetic modeling this observation could be attributed to uncorrect folded intermediates which are not capable of specific association of the monomers and/or generation of the disulfide bridges.

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Müller, Carsten: Verfahrenstechnische und kinetische Aspekte der Renaturierung des humanen Wachstumsfaktors aus Blutplättchen (PDGF) aus Einschlußkörpern. 1998.

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