Biochemische Charakterisierung der Pythochrome aus Pseudomonas aeruginosa und Aspergillus nidulans

Tasler, Ronja

Phytochrome sind Photorezeptoren, die auf hell- und dunkelrotes Licht reagieren. Sie kommen in Pflanzen, Cyanobakterien, einigen nicht-photosynthetischen Bakterien und Pilzen vor und tragen ein lineares Tetrapyrrol als prosthetische Gruppe. In der vorliegenden Arbeit gelang es, die Phytochrome PaBphP aus Pseudomonas aeruginosa und FphA aus Aspergillus nidulans rekombinant in E. coli darzustellen und die Funktion als Phytochrom in vitro zu charakterisieren. PaBphP reagiert mit Biliverdin IX (BV) auf hell- und dunkelrotes Licht. Im Grundzustand liegt PaBphP in der Pfr-Form vor und kann durch Einstrahlung von dunkelrotem Licht in die Pr-Form umgewandelt werden. Durch die Assemblierung von PaBphP mit verschiedenen BV-Isomeren wurde deutlich, dass der Chromophor mit der Endo-Vinyl-Gruppe des A-Rings kovalent am Protein bindet. Da das Gen bphP zusammen mit dem hämoxygenase-codierenden Gen bphO in einem Operon vorliegt, scheint der natürliche Chromophor BV IX zu sein. Zur Charakterisierung der Chromophor-Bindestelle wurden gezielt Aminosäuren ausgetauscht und die erhaltenen Varianten untersucht. Ein Cysteinrest in der N-terminalen PAS-Domäne ist an der Chromophor-Bindung beteiligt. Durch Autophosphorylierungsexperimente konnte die Funktion als Histidinkinase nachgewiesen werden. Obwohl alle biochemischen Daten auf einen Photorezeptor hinweisen, bleibt die Funktion von PaBphP unbekannt. Rekombinant gereinigtes holo-FphA aus A. nidulans zeigte ebenfalls alle Merkmale eines Phytochrom-Photorezeptors. Es assemblierte BV und das resultierende holo-FphA zeigte typische R/FR- Photoisomerisierung. Eine kovalente Bindung des BV an FphA wurde nachgewiesen. In FphA wird der Chromophor auch an einem konservierten Cysteinrest in der N-terminalen PAS-Domäne gebunden. Die Funktion von FphA als Histidinkinase wurde durch Autophosphorylierungsexperimente gezeigt. In A. nidulans hat FphA die Funktion eines Rotlichtsensors und unterdrückt die sexuelle Entwicklung unter hellrotem Licht.

Phytochromes are red-/far-red-light photoreceptors in plants, cyanobacteria, some non-photosynthetic bacteria and fungi. They carry a linear tetrapyrrole prosthetic group which is covalently bound to the protein. In this work the phytochrome PaBphP from P. aeruginosa and FphA from A. nidulans were recombinantly produced in E. coli and their function as a phytochrome was characterized in vitro. PaBphP is able to autocatalytically form a photoconvertible holo-phytochrome with BV IX. The ground state of PaBphP is the Pfr-form which can be converted to the Pr-form through illumination with far red light. To determine which part of the bilin is involved in covalent attachment to the protein various biliverdin derivatives were assembeled with apo-BphP. An A-ring endo vinyl group is absolutely required for covalent attachment. Since the bphP gene is located downstream from a bphO gene, which encodes a heme oxygenase, the natural chromophor of BphP seems to be BV IX. To investigate the chromophor binding site, site directed mutants were generated and analyzed. Interestingly, BphP binds biliverdin at a conserved cysteine residue in the N-terminal PAS-domain. Autophosphorylation experiments confirmed the function of BphP as a histidine kinase. Although all biochemical data are indicative of a real photoreceptor, its function in P. aeruginosa remains unclear. Recombinant produced holo-FphA showed also all characteristics of a bonafide phytochrome. It assembeled biliverdin in vitro and the resultant holo-FphA showed red-/far-red-light photoisomerization. Site directed mutagenesis identified a conserved cysteine residue in the N-terminal PAS-domain as chromophore binding site. FphA is a histidine kinase which was confirmed by autophosphorylation experiments. A weak activity has been observed in the Pr and Pfr form. FphA has the function of a red-light sensor in A. nidulans and represses sexual development under red light.

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Tasler, Ronja: Biochemische Charakterisierung der Pythochrome aus Pseudomonas aeruginosa und Aspergillus nidulans. 2006.

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