Die Phosphorylierung von Prp1p durch Prp4p-Kinase ist notwendig zur Aktivierung von prä-katalytischen Spleißosomen

Bottner, Claudia

Die Rolle von Prp1p und seiner Phosphorylierung durch die Prp4p-Kinase beim Aufbau und der Aktivierung von Spleißosomen wurde untersucht. Prp1p und Prp31p werden unabhängig von der Prp4p-Kinaseaktivität an prä-katalytische Komplexe gebunden, die entweder alle fünf snRNAs (U1.U2.U5.U4/U6) oder nur vier snRNAs (U2.U5.U4/U6) enthalten. In einer konditional letalen prp1-Mutante, wird Prp31p in prä-katalytischen Komplexen mit U1.U2.U5.U4/U6 und U2.U5.U4/U6 in gleichen Mengen wie unter permissiven Bedingungen nachgewiesen. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass in S. pombe Spleißosomen unabhängig von Prp1p aufgebaut werden. Sie sind ein Hinweis auf eine regulatorische Funktion der Phosphorylierung von Prp1p bei der Aktivierung des Spleißosoms. Die Analysen von Deletionsmutationen im N-Terminus von Prp1p in vivo ergaben, dass die strukturelle Integrität des N-Terminus zwar für die Funktion von Prp1p essentiell ist, dass er aber für die Assoziation mit prä-katalytischen Spleißosomen keine wesentliche Rolle spielt. In vitro wurden im N-Terminus von Prp1p mehrere Phosphorylierungsstellen der Prp4p-Kinase identifiziert, von denen das Threonin in Position 244 auch in vivo phosphoryliert wird. Die Analysen der mutierten in vitro Phosphorylierungsstellen in vivo bestätigen, dass weder die hochkonservierte Region in den Positionen 20-33 im N-Terminus von Prp1p, noch die Phosphorylierung des Threonins an Position 244 für die Assoziation von Prp1p mit prä-katalytischen Spleißkomplexen notwendig sind. Das ist ein weiterer Hinweis darauf, dass die Phosphorylierung von Prp1p durch die Prp4p-Kinase an prä-katalytischen Spleißosomen erfolgt. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird ein Modell der Regulation des prä-mRNA Spleißens in vivo vorgeschlagen, in dem die Phosphorylierung von Prp1p durch die Prp4p-Kinase an der Aktivierung von prä-katalytischen Spleißosomen beteiligt ist. Für den Aufbau von Spleißosomen wird Prp1p nicht benötigt.

The significance of phosphorylation of Prp1p by Prp4p-kinase in assembling and activation of splicesomes was investigated. Independent of the activity of Prp4p-kinase, Prp1p and Prp31p associate with pre-catalytic splicesomal complexes which contain either five (U1.U2.U5.U4/U6) or four snRNAs (U2.U5.U4/U6). In a conditional lethal mutant of prp1, the amounts of Prp31p present in precatalytic splicesomal complexes containing either U1.U2.U5.U4/U6 or U2.U5.U4/U6 are identical to those seen under permissive conditions. These results demonstrate that in S. pombe the assembly of spliceosomes was independent of Prp1p, indicating a regulatory function of phosphorylation of Prp1p for activation of spliceosomes. In vivo investigations of mutants harbouring deletions in the N-terminus of Prp1p showed that the structural integrity of the N-terminus is essential for the function of Prp1p but it does not play a considerable role in the association of Prp1p with pre-catalytic spliceosomes. We identified several in vitro phosphorylation sites of Prp4p-kinase in the N-terminus of Prp1p of which threonin in position 244 is also phosphorylated in vivo. Analysis of the in vitro phosphorylation sites in vivo confirmed, that neither the highly conserved region in position 20-30 in the N-terminus of Prp1p nor the phosphorylation of threonin 244 is necessary for association of Prp1p with pre-catalytic spliceosomal complexes, indicating that phosphorylation of Prp1p by Prp4p-kinase may proceed in pre-catalytic spliceosomes.On the basis of these experiments, we suggest a model for regulation of pre-mRNA splicing in vivo, in which the phosphorylation of Prp1p by Prp4p-kinase is essential for the activation of pre-catalytical spliceosomes but not for their assembly.

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Bottner, Claudia: Die Phosphorylierung von Prp1p durch Prp4p-Kinase ist notwendig zur Aktivierung von prä-katalytischen Spleißosomen. 2006.

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