Optimierung der Kultivierung und Monitoring der Proliferation und Differenzierung humaner primärer Knochenvorläuferzellen

Majore, Ingrida

Da die Verbesserung der In-vitro-Kultivierung isolierter osteogener Zellen und die verlässliche Überwachung des Kultivierungsprozesses zwei sehr wichtige Aspekte des Knochen-Tissue-Engineerings darstellt, wurden in der vorliegenden Arbeit die Kultivierungsbedingungen für humane primäre Knochenvorläuferzellen optimiert und eine Auswahl an Analysetechniken, welche den Verlauf der Osteogenese umfangreich widerspiegeln, zusammengestellt. Bevorzugt wurden dabei nicht-invasive Methoden, da nur diese die Zerstörung der 3D-Knochenimplantate während ihrer Herstellung ausschließen. Bei der Optimierung der Kultivierung wurden die osteogenen Humanzellen parallel in DMEM, alphaMEM, RPMI 1640 und ZKT-I-Medium kultiviert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Wahl des Mediums einen deutlichen Einfluss auf die Osteogenese, insbesondere auf die Mineralisierung der extrazellulären Matrix ausübt und dieser Prozess stark von der Calcium-Konzentration im Medium abhängig ist. Darüber hinaus wurde dargelegt, dass ein mit Humanserum (HS) angereichertes Medium für die Kultivierung humaner osteogener Zellen viel besser geeignet ist als ein FBS-haltiges, welches sowohl zu schwachem Zellwachstum als auch zu stark verzögerter Osteogenese führt. Die Kultivierung humaner osteogener Zellen in einem serumreduzierten Medium (2% HS + 5 ng/ml PDGF-BB + 5 ng/ml EGF) zeigte, dass dies wegen des stark überhöhten Tempos der Zelldifferenzierung nur über einen Zeitraum von ca. 2 Wochen und unter einer stetigen Zugabe von Wachstumsfaktoren anwendbar ist. Aus der Gesamtheit untersuchter Analyseverfahren wurden 6 Methoden ausgewählt (Ermittlung des Calcium- und Glucoseverbrauchs, der Lactatproduktion, der CICP-Freisetzung, der Aktivität von ALP, LDH und der Caspasen 3/7 im Kulturüberstand), die für eine nicht-invasive Überwachung humaner osteogener Zellkulturen ausreichend sind. Ferner wurde ein knochenspezifischer Microarray entwickelt, der eine Aussage über die Expression von 73 relevanten Genen ermöglicht.

Improvement of the in vitro cultivation of isolated osteogenic cells and the reliable monitoring of their cultivation process are two important aspects of bone tissue engineering. Therefore, this work is focussing on the optimization of culture conditions for human primary osteoprogenitor cells and the selection of analytical tools which allow a considerable insight into the sequence of osteogenesis. Non-invasive analytical methods were favoured because they avoid damage or destruction of produced 3D-bone implants. For optimization of the cultivation human osteoprogenitors were cultivated in parallel in DMEM, alphaMEM, RPMI 1640 und ZKT-I-medium. It could be demonstrated that the different basal media formulations had a substantial influence on osteogenesis, particularly on the mineralization of extracellular matrix. Furthermore, the mineralization process is strongly dependent on the calcium concentration in the medium. It was also demonstrated that media supplemented with human serum (HS) are more favourable for the cultivation of human osteogenic cells as media supplemented with foetal bovine serum (FBS). The latter resulted in slow cell growth and delayed osteogenesis. The cultivation of osteogenic cells under serum reduced conditions (2% HS + 5 ng/ml PDGF-BB + 5 ng/ml EGF) leads to an accelerated cell differentiation and is therefore applicable only over a period of approx. 2 weeks with steady addition of growth factors. Six analytical methods were identified for non-invasive, routine monitoring of human osteogenic cell cultures (determination of calcium and glucose consumption, lactate production, collagen I c-terminal propeptide release, alkaline phosphatase, lactate dehydrogenase and caspase 3/7 activities in the supernatant), out of the entirety of established analytical tools. In addition, a bone-specific DNA microarray was developed which allows the determination of the expression levels of 73 relevant genes.

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Majore, Ingrida: Optimierung der Kultivierung und Monitoring der Proliferation und Differenzierung humaner primärer Knochenvorläuferzellen. 2005.

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