Die Bildung von Protoporphyrin IX in Escherichia coli Charakterisierung der sauerstoffabhängigen Coproporphyrinogen III Oxidase (HemF) und der sauerstoffunabhängigen Protoporphyrinogen IX Oxidase

Breckau, Daniela

Die sauerstoffabhängige Coproporphyrinogen III Oxidase (HemF) aus Escherichia coli, welche die oxidative Decarboxylierung von Coproporphyrinogen III zu Protoporphyrinogen IX katalysiert, wurde im Rahmen dieser Arbeit rekombinant produziert und chromatographisch gereinigt. Es konnte eine Abhängigkeit der Aktivität des Enzyms von Mangan gezeigt werden. Mutagenesestudien identifizierten die Aminosäuren H96, H106, H145 und H175 als bedeutsam für die Katalyse. Mit Hilfe von Methoden wie ESR, Atomabsorption und UV/VIS - Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass H106 an der Manganbindung und H175 entweder an der Mangan- oder an der Substratbindung beteiligt sind. Als ein Produkt der enzymatischen Reaktion konnte neben Protoporphyrinogen IX Wasserstoffperoxid identifiziert werden. Ein Enzymmechanismus unter Beteiligung von Manganionen wurde abgeleitet. Die sauerstoffunabhängige Protoporphyrinogen IX Oxidase (PPO) katalysiert die Umsetzung von Protoporphyrinogen IX zu Protoporphyrin IX. In dieser Arbeit konnte ein Enzymtest für die PPO aus E. coli etabliert werden. Die E. coli PPO ist ein membranständiges Enzym, dessen Aktivität mit der Atmungskette gekoppelt ist. Eine Elektronenübertragung von der PPO auf die Fumarat Reduktase und die Beteiligung von HemG daran konnte nachgewiesen werden. Ausgehend von den aus der E. coli Membranfraktion solubilisierten Proteinen wurde eine erste säulenchromatographische Reinigung der Protoporphyrinogen IX Oxidase durchgeführt. Dabei wurde eine 1456fache Anreicherung der PPO Aktivität durch Chromatographie über DEAE Sepharose FF, CM Sepharose FF, SP Sepharose FF und Blue Sepharose FF erreicht. Massenspektrometrische Untersuchungen der erhaltenen Proteinfraktionen gaben bisher noch keine Hinweise auf mögliche Kandidaten mit Protoporphyrinogen IX Oxidase Funktion.

The oxygen-dependent coproporphyrinogen III oxidase (HemF) from Escherichia coli is catalyzing the oxidative decarboxylation of coproporphyrinogen III to protoporphyrinogen IX. The activity of the purified, recombinant HemF could be shown to be manganese dependent. By mutagenesis the amino acids H96, H106, H145 und H175 were identified as catalytic important. With help of EPR, atomic absorption and uv/vis – spectroscopy the function of H106 in manganese binding and of H175 in manganese or substrate binding was demonstrated. As a product of enzymatic reaction hydrogen peroxide was identified and a mechanism for HemF catalysis with participation of manganese ions was postulated. The oxygen-independent protoporphyrinogen IX oxidase (PPO) is catalyzing the oxidation of protoporphyrinogen IX to protoporphyrin IX. Within this work an enzyme assay for PPO from E. coli was established. E. coli PPO is a membrane associated enzyme, whose activity is coupled to the electron transport chain. The electron transfer from PPO to fumarate reductase with participation of HemG could be shown. From the membrane fraction solubilised proteins were used for a first chromatographic purification of protoporphyrinogen IX oxidase . An accumulation of PPO was reached by chromatography with DEAE sepharose FF, CM sepharose FF, SP sepharose FF and Blue sepharose FF. Analysis of the received protein fractions via mass spectrometry did not result in convincing candidates as possible protoporphyrinogen IX oxidase.

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Breckau, Daniela: Die Bildung von Protoporphyrin IX in Escherichia coli Charakterisierung der sauerstoffabhängigen Coproporphyrinogen III Oxidase (HemF) und der sauerstoffunabhängigen Protoporphyrinogen IX Oxidase. 2005.

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