Die Porphobilinogensynthase aus Pseudomonas aeruginosa: Katalytischer Mechanismus und Evolution der Metallabhängigkeit

Frère, Frederic

Porphobilinogensynthasen katalysieren die asymmetrische Kondensation von zwei Molekülen ALA zum Monopyrrol PBG und sind integraler Bestandteil im Biosyntheseweg von Tetrapyrrolen. Durch die Kristallisation des Enzyms im Komplex mit dem Inhibitor 5-Flourlävulinsäure konnten die Struktur des mit Substrat beladenen Enzyms zum Zeitpunkt des Starts der Katalyse, sowie die ersten Schritte im Reaktionsverlauf modelliert werden. Ein Reaktionsmechanismus konnte formuliert werden, der die Aktivierung des Substrats in der A-Stelle in Form eines Enamins, die Bildung der C-C-Bindung als erstem Reaktionsschritt und die Beteiligung eines monovalenten Kations beinhaltet. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht, den potentiellen evolutorischen Übergang zwischen rein Mg2+-abhängigen und gemischt Mg2+- und Zn2+-abhängigen PBGSen in vitro nachzuverfolgen und die Funktion der Metallbindestelle ZnB zu klären. Dazu wurde diese Bindestelle in das aktive Zentrum von PaPBGS durch schrittweisen Austausch der Reste A129, D131 und D139 gegen Cysteine integriert. Der Vergleich der dabei erzeugten sieben Mutanten anhand ihrer kinetischen Parameter sowie ihrer Strukturen identifizierte zwei Mutanten, die eine deutliche Zn2+-abhängige Aktivität, eine Zinkbindestellen mit unverzerrter Koordinationsgeometrie, sowie eine hohe Besetzung mit Zn2+ aufwiesen. Diese Mutanten sind die einzigen, für die äquivalente PBGSen in der Natur vorkommen. Zwei weitere Mutationen, die das aktive Zentrum der Dreifachmutanten weiter an das von EcPBGS annäherten (P132E und K229R), führten zu einer Steigerung der Aktivität der so modifizierten Enzyme. Die erfolgreiche Integration der Zinkbindestelle in PaPBGS bei gleichzeitigem Erhalt der Enzymaktivität lässt darauf schließen, dass das Zinkion an keinem der integralen Schritte der Katalyse beteiligt ist, sondern an der Bindung und Orientierung von Substrat-, Intermediat- und Produktmolekülen. Eine Evolution von Zn2+-freier PBGS aus Zn2+-abhängiger PBGS wurde abgeleitet.

Porphobilinogen synthases catalyse the asymmetric condensation of two molecules of ALA to form the monopyrrole PBG, an integral step in tetrapyrrole biosynthesis. The crystallization of the enzyme in complex with the inhibitor 5-flourolevulinic acid allowed the modeling of the substrate loaded enzyme and important steps of catalysis: activation of the substrate as enamine, formation of the C-C-bond as first reaction step and the catalytic effect of a monovalent cation. In the second part of the work the function of metal binding site ZnB was examined and the evolutionary path connecting exclusively Mg(II) dependent with mixed Mg(II) and Zn(II) dependent PBGSs was analyzed. Therefore the binding site ZnB was introduced into PaPBGS through stepwise exchange of residues A129, D131 and D139 against cysteines. The comparison of the seven new mutants identified two that showed a strongly Zn(II) dependent activity, an undistorted zinc binding site and a high zinc occupancy. Only for these two mutants equivalents exist in nature. Two additional mutations, further aligning the active center of this mutants to that of EcPBGS (P132E and K229R), enhanced the activity of the new mutants. That integration of ZnB into PaPBGS was possible, while the enzyme activity was not abolished lead to the conclusion, that the zinc ion is not directly involved in catalysis, but aids binding and orientating of substrate, intermediates and the product. An evolution of zinc free PBGS from zinc dependent PBGS was deduced.

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Frère, Frederic: Die Porphobilinogensynthase aus Pseudomonas aeruginosa: Katalytischer Mechanismus und Evolution der Metallabhängigkeit. 2005.

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