DNA-Rekombination in Pflanzen durch funktionelle Rekombinaseaktivierung

Biernacki, Stephanie

Für die Entfernung von Markergenen aus transgenen Pflanzen wurde ein auf dem FLP/FRT-System aus S. cerevisiae basierendes System getestet. Die Aktivität der Rekombinase wurde hierbei über die Fusion mit der Liganden-Bindungs-Domäne (LBD) von Steroidrezeptoren direkt reguliert. Dieses System wurde bisher noch nicht in pflanzlichen Organismen getestet. Mittels transienter Inokulationsversuche konnte in N. benthamiana gezeigt werden, dass eine Regulation der FLP-Rekombinase auf Proteinebene über die Fusion des Proteins mit der LBD eines Steroidrezeptors auch in Pflanzen möglich ist. Durch die Fusion der FLP-Rekombinase mit verschiedenen LBDs sollte der in Pflanzen am besten geeignete Steroidrezeptor identifiziert werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die LBD des Glucocorticoidrezeptors die beste Effizienz aufweist. Um das System auch für Mehrfachtransformationen einsetzen zu können, wurden FRTsite-Mutanten in verschiedenen Kombinationen in transienten Tests analysiert. Zusätzlich zur Wildtyp-FRTsite konnten zwei Mutanten identifiziert werden, die weder miteinander noch mit der Wildtyp-FRTsite rekombinieren und ähnlich gute Rekombinationseffizienzen wir der Wildtyp aufweisen. Dadurch ist es möglich, bis zu drei aufeinander folgende Mehrfachtransformationen inkl. anschließender Rekombination durchzuführen.

Based on the FLP/FRT-system of S. cerevisiae a system for marker gene elimination in transgenic plants was tested. The activity of the recombinase was directly regulated by fusing it to the ligand-binding domain (LBD) of a steroid hormone receptor. This system had not been tested in plants until then. In transient inoculation experiments using N. benthamiana it could be shown that regulation of the FLP recombinase fused to different LBDs was feasible in plants. To identify the most suitable steroid receptor the FLP recombinase was combined with different LBDs. The best efficiency was attained using the LBD of the glucocorticoid receptor. In order to additionally use the system for multiple transformation rounds, different combinations of FRTsite mutants were analyzed in transient assays. In addition to the wildtype FRTsite, two FRTsite mutants were identified, that recombine neither with each other nor with the wildtype FRTsite. These FRTsite mutants showed comparable recombination efficiency as the wildtype. Thereby it is possible to use the system in up to three consecutive transformation events.

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Biernacki, Stephanie: DNA-Rekombination in Pflanzen durch funktionelle Rekombinaseaktivierung. 2003.

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